论文部分内容阅读
目的：
应用大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell typeⅡ，AECⅡ)的缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygeneration，H/R)模型及SD大鼠肺缺血/再灌注损伤(Lung ischemia/reperfusion injury，LIRI)在体模型，探讨细胞自噬(Autophagy)在缺血/再灌注(缺氧/复氧)肺损伤中的作用及姜黄素(Curcumin)的干预效果，为姜黄素在防治肺缺血/再灌注(缺氧/复氧)损伤中的临床应用提供新的理论依据。
方法：
(一)机制探索实验
1.使用大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，随机分为5组(n=5)，分别为①对照组(C)：使用DMEM高糖培养液，常氧培养30h；②缺氧/复氧组(H/R)：使用无糖培养液，缺氧中培养6h，再用高糖DMEM培养液常氧培养24h；③DMSO溶剂组(HD)：在H/R基础上，缺氧前1h，用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)预处理细胞；④自噬激动剂组(Rap)：缺氧前1h用雷帕霉素(Rapamycin)预处理细胞；⑤自噬抑制剂组(3-MA)：缺氧前1h用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)预处理。造模结束，CCK-8检测各组细胞活力；Western blot检测自噬相关蛋白AMPK、mTOR磷酸化水平以及Beclin1、LC3Ⅱ、P62蛋白水平的表达，RT-PCR检测LC3、Beclin1、AMPK、mTOR、p62mRNA的表达。
2.将40只SD大鼠随机分为5组(每组n=8)，分别为①假手术组(sham组)：只开胸3.5h；②缺血/再灌注组(I/R组)：开胸夹闭肺门缺血0.5h后再灌注3h；③溶剂组(DMSO组)④自噬激动剂组(Rap组)⑤自噬抑制剂组(3-MA组)：后三组分别在气管插管前1h腹腔注射DMSO溶液、雷帕霉素溶液、3-MA溶液，余同I/R组。实验结束后处死大鼠，取肺组织，记录并计算肺组织湿/干重比(W/D)、总肺含水量变化(TLW)，光镜和电镜观察组织及细胞形态，WB检测自噬相关蛋白的表达情况。
(二)姜黄素干预实验
将40只SD大鼠随机分为5组(每组n=8)，分别为①假手术组(sham组)只开胸3.5h；②缺血/再灌注组(I/R组)：开胸夹闭肺门缺血0.5h后再灌注3h；③溶剂组(DMSO组)④姜黄素组(CUR组)⑤CUR+激动剂组(CUR-Rap组)气管插管前1h分别腹腔注射DMSO溶液、姜黄素溶液、姜黄素-雷帕霉素混合溶液，余同I/R组。实验结束后取肺组织测算肺组织W/D、TLW，氧化应激指标SOD、MDA，光镜和电镜观察肺组织及细胞形态，WB检测自噬相关蛋白的表达情况。
结果：
(一)探索机制的细胞实验中，除C组外，其余各组细胞活力均有下降，自噬相关蛋白表达水平上升，即p-AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高，而p-mTOR、p62蛋白表达降低(P＜0.05或P＜0.01);自噬相关蛋白基因转录上升：即AMPK、Beclin1、LC3mRNA表达水平升高，而mTOR、p62mRNA表达降低(P＜0.05或P＜0.01)；与Rap、H/R和HD组相比，3-MA组的细胞活力较高，自噬相关蛋白及其基因转录表达下降，而Rap、H/R和HD组间细胞活力即自噬水平表达无明显差异(P＞0.05)。动物实验中，相对于sham组，其余各组肺W/D、TLW升高，自噬相关蛋白表达上升，p-AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白明显增多，p-mTOR、p62蛋白减少(P＜0.05或P＜0.01)，光镜下其余各组肺组织有不同程度的水肿渗出，肺泡结构紊乱，电镜下细胞超微结构损伤加重，部分可见自噬小体；与DMSO组相比，3-MA组肺W/D、TLW有下降(P＜0.05或P＜0.01)，自噬相关蛋白表达下降，肺间质水肿较轻，细胞渗出较少，细胞超微结构损伤减轻，未见自噬小体。而I/R、DMSO、Rap组的各项指标变化无统计学差异(P＞0.05)。
(二)姜黄素干预实验中，相对于sham组，其余各组肺组织W/D、TLW均上升，SOD下降而MDA上升，自噬相关蛋白表达增加(P＜0.01)，肺组织损伤加重且细胞超微结构破坏加重；DMSO组与I/R组各项指标差别无统计学意义(P＞0.05)；与DMSO组相比，CUR组肺W/D、TLW均有下降，SOD上升而MDA下降，p-AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白减少，p-mTOR、P62蛋白表达增多(P＜0.01)，肺组织水肿渗出少，肺泡结构紊乱度较低，细胞超微结构损伤较轻，未见自噬小体；与CUR相比，CUR-Rap组肺W/D、TLW有升高，SOD下降、MDA上升，自噬相关蛋白表达上升(P＜0.01)，肺组织损伤加剧，细胞超微结构破坏更重，可见自噬小体。
结论：
1.缺血/再灌注(缺氧/复氧)可激活细胞自噬引起大鼠肺损伤；
2.姜黄素可减轻大鼠肺缺血/再灌注损伤，其机制可能与其减轻氧化应激反应、抑制细胞自噬有关。
应用大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell typeⅡ，AECⅡ)的缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygeneration，H/R)模型及SD大鼠肺缺血/再灌注损伤(Lung ischemia/reperfusion injury，LIRI)在体模型，探讨细胞自噬(Autophagy)在缺血/再灌注(缺氧/复氧)肺损伤中的作用及姜黄素(Curcumin)的干预效果，为姜黄素在防治肺缺血/再灌注(缺氧/复氧)损伤中的临床应用提供新的理论依据。
方法：
(一)机制探索实验
1.使用大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，随机分为5组(n=5)，分别为①对照组(C)：使用DMEM高糖培养液，常氧培养30h；②缺氧/复氧组(H/R)：使用无糖培养液，缺氧中培养6h，再用高糖DMEM培养液常氧培养24h；③DMSO溶剂组(HD)：在H/R基础上，缺氧前1h，用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)预处理细胞；④自噬激动剂组(Rap)：缺氧前1h用雷帕霉素(Rapamycin)预处理细胞；⑤自噬抑制剂组(3-MA)：缺氧前1h用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)预处理。造模结束，CCK-8检测各组细胞活力；Western blot检测自噬相关蛋白AMPK、mTOR磷酸化水平以及Beclin1、LC3Ⅱ、P62蛋白水平的表达，RT-PCR检测LC3、Beclin1、AMPK、mTOR、p62mRNA的表达。
2.将40只SD大鼠随机分为5组(每组n=8)，分别为①假手术组(sham组)：只开胸3.5h；②缺血/再灌注组(I/R组)：开胸夹闭肺门缺血0.5h后再灌注3h；③溶剂组(DMSO组)④自噬激动剂组(Rap组)⑤自噬抑制剂组(3-MA组)：后三组分别在气管插管前1h腹腔注射DMSO溶液、雷帕霉素溶液、3-MA溶液，余同I/R组。实验结束后处死大鼠，取肺组织，记录并计算肺组织湿/干重比(W/D)、总肺含水量变化(TLW)，光镜和电镜观察组织及细胞形态，WB检测自噬相关蛋白的表达情况。
(二)姜黄素干预实验
将40只SD大鼠随机分为5组(每组n=8)，分别为①假手术组(sham组)只开胸3.5h；②缺血/再灌注组(I/R组)：开胸夹闭肺门缺血0.5h后再灌注3h；③溶剂组(DMSO组)④姜黄素组(CUR组)⑤CUR+激动剂组(CUR-Rap组)气管插管前1h分别腹腔注射DMSO溶液、姜黄素溶液、姜黄素-雷帕霉素混合溶液，余同I/R组。实验结束后取肺组织测算肺组织W/D、TLW，氧化应激指标SOD、MDA，光镜和电镜观察肺组织及细胞形态，WB检测自噬相关蛋白的表达情况。
结果：
(一)探索机制的细胞实验中，除C组外，其余各组细胞活力均有下降，自噬相关蛋白表达水平上升，即p-AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高，而p-mTOR、p62蛋白表达降低(P＜0.05或P＜0.01);自噬相关蛋白基因转录上升：即AMPK、Beclin1、LC3mRNA表达水平升高，而mTOR、p62mRNA表达降低(P＜0.05或P＜0.01)；与Rap、H/R和HD组相比，3-MA组的细胞活力较高，自噬相关蛋白及其基因转录表达下降，而Rap、H/R和HD组间细胞活力即自噬水平表达无明显差异(P＞0.05)。动物实验中，相对于sham组，其余各组肺W/D、TLW升高，自噬相关蛋白表达上升，p-AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白明显增多，p-mTOR、p62蛋白减少(P＜0.05或P＜0.01)，光镜下其余各组肺组织有不同程度的水肿渗出，肺泡结构紊乱，电镜下细胞超微结构损伤加重，部分可见自噬小体；与DMSO组相比，3-MA组肺W/D、TLW有下降(P＜0.05或P＜0.01)，自噬相关蛋白表达下降，肺间质水肿较轻，细胞渗出较少，细胞超微结构损伤减轻，未见自噬小体。而I/R、DMSO、Rap组的各项指标变化无统计学差异(P＞0.05)。
(二)姜黄素干预实验中，相对于sham组，其余各组肺组织W/D、TLW均上升，SOD下降而MDA上升，自噬相关蛋白表达增加(P＜0.01)，肺组织损伤加重且细胞超微结构破坏加重；DMSO组与I/R组各项指标差别无统计学意义(P＞0.05)；与DMSO组相比，CUR组肺W/D、TLW均有下降，SOD上升而MDA下降，p-AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白减少，p-mTOR、P62蛋白表达增多(P＜0.01)，肺组织水肿渗出少，肺泡结构紊乱度较低，细胞超微结构损伤较轻，未见自噬小体；与CUR相比，CUR-Rap组肺W/D、TLW有升高，SOD下降、MDA上升，自噬相关蛋白表达上升(P＜0.01)，肺组织损伤加剧，细胞超微结构破坏更重，可见自噬小体。
结论：
1.缺血/再灌注(缺氧/复氧)可激活细胞自噬引起大鼠肺损伤；
2.姜黄素可减轻大鼠肺缺血/再灌注损伤，其机制可能与其减轻氧化应激反应、抑制细胞自噬有关。