淡紫拟青霉液体发酵工艺及其制剂的研究

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淡紫拟青霉是防治植物寄生线虫最有潜力的生防菌株之一,但是其采用液体深层方法大量生产、孢子粉制备、制剂加工和存储等方面的研究都处于起步阶段,制约着其应用到实际生产当中。因此,开展液体深层发酵大量生产淡紫拟青霉、孢子粉制备及其制剂开发等方面的研究是非常有实用价值和意义的。本研究以卵寄生真菌淡紫拟青霉20-7为研究对象,通过摇瓶发酵优化得到淡紫拟青霉20-7液体发酵最佳培养基及其初始pH值;通过小型发酵罐中发酵生产得到最佳发酵条件;比较了几种淡紫拟青霉20-7孢子粉的制备方法;通过菌丝生长法、分生孢子萌发法和生测实验筛选得到与淡紫拟青霉20-7具有较好相容性的增效剂和制剂加工所用载体和助剂;比较了几种淡紫拟青霉20-7制剂在不同温度下的货架期。其主要结果如下:(1)确定了淡紫拟青霉20-7发酵培养基的最佳C/N(质量比)为8:1,碳浓度为160g/L;添加土豆浸汁和鸡蛋黄有助于产孢量的提高和产孢周期缩短;采用CaCO3作为发酵液中的缓冲物质可以提高产孢量。即:改进后的培养基配方(g/L):葡萄糖160, NaNO310,(NH4)2SO45,黄豆粉5, KH2PO41.5, MgSO4·7H2O1.5,1%鸡蛋黄或200g土豆浸出液,CaC032。(2)确定了淡紫拟青霉20-7在小型发酵罐中发酵产孢的最佳工艺条件:罐压0.06-0.08Mpa,温度为27℃,初始pH值为6,pH值不进行控制或者加入适量的碳酸钙来缓冲;转速和通气量控制:0-48h之间转速100r/min,通气量200L/h;48h-60h之间转速调至150r/min;60h之后,通气量调至250L/h,转速为150r/min;84h后转速调至200r/min;108h后转速调至150r/min,通气调整为200L/h,发酵周期为84-96h。(3)确定了离心法回收发酵液中分生孢子的最佳工艺条件:絮凝剂KA1(SO4)22.0g/100ml,相对离心力为4000g,离心时间为30min。(4)淡紫拟青霉20-7孢子粉的干燥效果与干燥方法有关。比较了不同温度下孢子粉的烘干效果,确定了最佳烘干温度为35℃;不同情况可以选用不同的干燥方法,也可以将几种干燥方法混合使用。(5)通过真空冷冻干燥法干燥淡紫拟青霉20-7分生孢子,筛选得到三种糖类冷冻保护剂:10%乳糖、10%木糖和10%麦芽糖,冷冻保护效果均达到80%以上;两种聚合物冷冻保护剂:5%甘油和1%CMCNa,但是保护效果较低,只有60%左右;一种氨基酸累冷冻保护剂:10%谷氨酸钠,保护剂效果可到70%以上;一种蛋白类冷冻保护剂:4%蛋白胨,保护效果较低,只有60%左右。(6)筛选得到几种对淡紫拟青霉20-7生长影响较小的增效剂:0-1%福气多;0.1-100mg/L吲哚乙酸、0.5~50mg/L2,4-D;500~1000mg/ml草酸、10-100mg/L水杨酸;1%NH4O3和NH4Cl。(7)淡紫拟青霉20-7分生孢子萌发促进剂的最佳配方为:0.1%蛋白胨,0.1%维生素B1,0.1%L-丙氨酸,0.15%蔗糖。通过生测试验表明:与根结线虫作用5d,其寄生率可达到80%以上,卵孵化率几乎为O。(8)淡紫拟青霉20-7制剂加工所用载体:高岭土或硅藻土,硅藻土最佳;分散剂:D1002、NNO、木质素磺酸钠或木质素磺酸钙;润湿剂:Tween-20, PEG和PVA;稳定剂:PEG和草酸;抗紫外保护剂:核黄素和荧光素钠。(9)可湿性粉剂配方:孢子粉:50%;分散剂:2-5%;抗紫外保护剂:0.5-2%;稳定剂:0.5-1%;润湿剂:1-2%;0.1-1000mg/L植物生长激素,0.5-2%无机盐增效剂或者营养物质孢子萌发促进剂;载体补到100%。(10)淡紫拟青霉20-7制剂的货架期与剂型和保存温度有关,低温保存优于常温保存;微胶囊菌剂的货架期高于颗粒剂和粉剂。微胶囊菌剂在低温下和常温下都可以保存12个月以上;但是其他剂型只有在低温下才能保存6个月以上,常温下只能保存3个月。
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