新科斯糖的生物制备及其月桂酸酯的酶法合成

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新科斯糖是一种蔗果三糖族低聚果糖,具有较1F-低聚果糖更好的促益生菌能力,被称为“高效益生元”,是一种功能性甜味剂。然而,由于植物提取新科斯糖产量较低且受季节性限制,而微生物发酵法由于能产合成新科斯糖的酶(~6G-果糖苷酶)的微生物较少且产量低,不具备工业化生产潜力,因此目前尚未有商品化的新科斯糖产品问世。本研究首先开发了法夫酵母全细胞法生产新科斯糖的工艺,确立了~6G-果糖苷酶和虾青素联产发酵方式,以期降低新科斯糖的生产成本,加速其工业化生产进程。同时,研究了高纯度(P90)新科斯糖的食品加工性质,以对新科斯糖将来在食品中的应用提供理论指导。最后,对新科斯糖分子进行了酯化改性,以期进一步扩大新科斯糖的应用范围。通过考察法夫酵母全细胞产新科斯糖的规律,确定其最佳产糖工艺条件。法夫酵母细胞在中性pH条件下显示了最佳的果糖苷酶活力;细胞浓度与新科斯糖产量非正相关,高浓度的细胞(>80g/L)会导致合成的新科斯糖水解;蔗糖浓度的增加可以显著增加新科斯糖产量,但同时会降低新科斯糖的生产效率;提高反应温度会显著增加法夫酵母细胞的果糖苷酶活力;细胞酶活特性与其种龄密切相关,指数生长期的细胞具有较高的果糖苷酶活力,稳定期的细胞具有较高的水解酶活力。在优化的工艺条件即:细胞种龄32h,浓度80g/L,蔗糖水溶液浓度400g/L,转化温度30℃,转化时间4h,新科斯糖产量可以达到227.72g/L。根据法夫酵母可产虾青素作为高附加值产品的特点,优化了~6G-果糖苷酶和虾青素联产的培养基成分和发酵条件,以期降低新科斯糖的生产成本。单因素实验结果显示蔗糖和玉米浆是~6G-果糖苷酶和虾青素联产的最佳碳源和氮源;Plackett-Burman实验设计优化结果显示玉米浆和pH是影响~6G-果糖苷酶和虾青素联产的关键因素;中心组合实验结果显示玉米浆浓度为52.5mL/L,pH为7.9时,~6G-果糖苷酶和虾青素联产可以达到最佳产量,分别为242.57U/mL和5.23mg/L;在优化的培养条件下,采用全细胞生物转化工艺,新科斯糖的最大生产效率为119.06g/L/h,且成本分析显示培养基成本较优化前降低了66.3%。此研究进一步加速了新科斯糖的工业化生产进程。通过模拟不同的杀菌热处理条件,研究了新科斯糖的酸热稳定性,结果表明:新科斯糖在中性和碱性环境下均非常稳定性,可耐受巴氏杀菌(85℃,60min),高温短时间(100℃,30min和121℃,20min)及超高温瞬时(135℃,30s)热处理。在酸性环境下,pH为2和3的新科斯糖溶液经85℃,30min热处理,保留率分别为42.04%和78.99%;pH为4的新科斯糖溶液经100℃,30min和121℃,20min热处理,保留率分别为97.08%和89.83%。运用DSC技术,研究了新科斯糖对大米淀粉糊化及老化性质的影响,结果显示:新科斯糖可以提高大米淀粉初始糊化温度,与低聚果糖,异麦芽糖及蔗糖相比,对初始糊化温度的增加程度大小顺序为:低聚果糖>新科斯糖>异麦芽糖>蔗糖;新科斯糖可以降低淀粉糊化焓值,降低程度与新科斯糖的加入量成正相关性。新科斯糖对淀粉老化行为影响结果表明:淀粉在4℃储藏时,低浓度(10%)新科斯糖在短期内(7天)和长期内(28天)均可以显著抑制淀粉的老化;而高浓度新科斯糖(30%)在长期内可以抑制淀粉老化。淀粉储藏在25℃时,低浓度(10%)的新科斯糖在长期内(28天)会抑制淀粉老化,其他情况下对淀粉老化行为影响效果不显著。与FOS,IMO相比,新科斯糖抗淀粉老化效果优于FOS和IMO。采用月桂酸乙烯酯成功对新科斯糖进行了酰化改性,经LC-MS初步鉴定产物为新科斯糖月桂酸单酯。通过对新科斯糖月桂酸酯合成规律的考察,确定了最佳反应条件:反应体系为DMSO和2-甲基-2-丁醇(2:8;v/v),新科斯糖与月桂酸乙烯酯的分子摩尔比为1:12,反应温度为50℃,分子筛添加量为100g/L,Novozyme435添加量为10g/L,反应32h后,转化率达到82.38%。在对反应进程研究的基础上,制定了新科斯糖补料策略(每隔8h补新科斯糖0.01M),连续补加8次后,新科斯糖月桂酸酯的产量提高了4.47倍,达到61.35mg/mL。采用C18固相萃取色谱柱对合成的新科斯糖月桂酸酯进行了纯化,并采用1H和13C NMR,COSY和HMQC对合成的糖酯进行了结构鉴定,结果显示糖酯为新科斯糖-6-月桂酸酯。最后,采用Du Nouy吊片法测定了其CMC值,结果为352μmol/L。
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