mmucirc0000451促进小鼠Th17细胞分化的实验研究

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目的:在体外诱导的Th17细胞中筛选出差异性表达的环状RNA分子(circular RNA,circRNA);明确其中一种circRNA mmucirc0000451对Th17细胞分化的调控作用并分析其潜在的调控机制。方法:(1)免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏来源的初始型CD4+T细胞,流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞纯度。以5×105/孔的细胞量在预包被抗CD3mAb(2μg/mL),抗CD28 mAb(2μg/mL)的48孔板中进行Th0细胞和Th17细胞的诱导,Th17细胞诱导体系还需加入TGF-β(2ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(50ng/mL)、抗IL-4 mAb(5μg/mL)和抗IFN-γmAb(5μg/mL)。37℃,5%CO2条件下培养72小时后加入1μL/孔的细胞因子刺激剂继续培养5小时。通过FCM检测Th17细胞诱导比例,酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测Th17细胞培养上清中IL-17A的表达水平。将诱导的Th0细胞和Th17细胞进行circRNA高通量测序(委托杭州和壹基因科技有限公司),对两种细胞的circRNA表达情况进行分析,筛选出差异性表达的circRNA mmucirc0000451。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测mmucirc0000451在Th17细胞中的表达,并对mmucirc0000451的基本信息进行验证。(2)为了了解mmucirc0000451在Th17细胞分化过程中的作用,我们在Th17细胞的诱导体系中加入过表达mmucirc0000451的腺病毒载体,qRT-PCR验证过表达效率。FCM检测Th17细胞比例,ELISA检测Th17细胞培养上清中IL-17A的表达水平。此外,我们设计mmucirc0000451特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),在Th17细胞的诱导体系中加入mmucirc0000451siRNA,qRT-PCR验证干扰效率。FCM检测Th17细胞比例,ELISA检测Th17细胞分泌的IL-17A水平。(3)为了确定mmucirc0000451可能的作用机制,采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)和核浆分离方法检测mmucirc0000451在Th17细胞中的定位。(4)为了确定mmucirc0000451对亲本基因CDYL的调控作用,首先qRT-PCR和Western blot检测Th17细胞中CDYL的表达情况。在Th17细胞的诱导体系中加入过表达mmucirc0000451的腺病毒载体,qRT-PCR验证过表达效率和CDYL mRNA水平;在Th17细胞的诱导体系中加入mmucirc0000451 siRNA,qRT-PCR验证干扰效率和CDYL mRNA水平;Western blot检测CDYL蛋白水平以及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)检测CDYL与EZH2的结合能力。(5)在Th17细胞的诱导体系中加入EZH2抑制剂GSK343,WB检测抑制效果,FCM检测Th17细胞比例。(6)为了探究体内mmucirc0000451对CIA小鼠疾病进展及相关指标的影响,我们将DBA小鼠随机分为三组(simmucirc0000451组,siNC组及DBA组),用DBA小鼠进行CIA模型的构建,在第0天及21天分别免疫小鼠。在模型构建过程中的第19天,将5×106数量的simmucirc0000451的CD4+T细胞,siNCe的CD4+T细胞及PBS分别通过尾静脉注射入对应组别DBA小鼠体内。分别观察三组小鼠疾病进展(临床评分,CIA发病率),流式细胞术检测脾脏及淋巴结中Th17细胞的比例。结果:(1)小鼠脾脏来源的初始型CD4+T细胞的纯度为92.8%,体外诱导的Th17细胞比例为12.66±0.23%。高通量测序技术检测发现Th0细胞中表达的circRNA有400个,Th17细胞中表达的circRNA有310个,其中两者共同表达16个circRNA。来源于CDYL(chromodomain Y like protein)的mmucirc0000451的差异性表达最为明显。与Th0细胞相比,mmucirc0000451在Th17细胞中显著高表达(P<0.05)。与线性CDYL相比,mmucirc0000451不易被核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)降解(P>0.05)。Sanger测序检测mmucirc0000451首尾拼接的剪切位点与数据库(circBase,http://www.circbase.org/)中一致。(2)在Th17细胞诱导过程中过表达mmucirc0000451后,mmucirc0000451表达显著上调(P<0.005)。过表达组Th17细胞比例为18.16±0.64%,对照组比例为12.47±0.55%,两组具有显著性差异(P<0.005);过表达组培养上清中IL-17A浓度为2585±91.62pg/mL,对照组浓度为1751±70.34pg/mL,过表达组明显高于对照组(P<0.005)。在诱导过程中特异性干扰mmucirc0000451后,mmucirc0000451表达下调(P<0.0001)。干扰组Th17细胞比例为8.140±0.61%,对照组Th17细胞比例为13.25±0.25%,干扰组明显低于对照组(P<0.05);干扰组培养上清中IL-17A浓度为1473±121.10pg/mL,对照组浓度为2151±97.39pg/mL,干扰组明显低于对照组(P<0.05)。(3)FISH定位和核浆分离实验显示mmucirc0000451主要位于Th17细胞的细胞质中。(4)与Th0细胞相比,Th17细胞中CDYL表达增高。在诱导过程中加入mmucirc0000451过表达腺病毒,CDYL mRNA水平显著上升(P<0.05)在诱导过程中加入特异性干扰mmucirc0000451,CDYL mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05);EZH2与CDYL的结合也明显减弱。(5)在Th17细胞诱导体系中加入EZH2抑制剂GSK343,Th17细胞分化比例明显降低。(6)过继转移simmucirc0000451的CD4+T细胞组的CIA发病率和平均关节炎指数明显低于过继转移siNC的CD4+T细胞组及DBA组。各组脾脏中Th17细胞比例无明显改变(P>0.05);过继转移simmucirc0000451的CD4+T细胞组的中淋巴结Th17细胞比例略低于过继转移siNC的CD4+T细胞组(P<0.05)。结论:(1)mmucirc0000451在体外诱导的Th17细胞中高表达,可以促进Th17细胞的分化。(2)mmucirc0000451主要分布在Th17细胞胞质中,促进CDYL表达。(3)mmucirc0000451通过加强CDYL和EZH2结合,增强EZH2的功能,诱导初始型CD4+T细胞向Th17细胞分化。(4)mmucirc0000451表达下调的CD4+T细胞,促炎作用减弱。
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