【摘 要】
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无脊椎动物天然免疫（Innate immunity）系统的启动由体内的模式识别受体（PatternRecognition Receptors， PRRs）对外源入侵病原物表面相关分子模式（Pathogen AssociatedMolecular Patterns, PAMPs）的识别引起。在昆虫和其他节肢动物中，肽聚糖识别蛋白（Peptidoglycan Recognition Proteins，
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无脊椎动物天然免疫（Innate immunity）系统的启动由体内的模式识别受体（PatternRecognition Receptors， PRRs）对外源入侵病原物表面相关分子模式（Pathogen AssociatedMolecular Patterns, PAMPs）的识别引起。在昆虫和其他节肢动物中，肽聚糖识别蛋白（Peptidoglycan Recognition Proteins，PGRPs）作为一类PRR，可以结合并识别细菌表面的肽聚糖（Peptidoglycan，PG），在激活免疫调控途径中有着重要作用。果蝇（Drosophilamelanogaster）中有关PGRPs在免疫过程中的研究较多，家蚕（Bombyx mori）的PGRP家族中有12个不同的PGRP基因，然而大部分功能至今还并不清楚。本实验以家蚕为研究对象，克隆了PGRP-S5基因，并对其在家蚕免疫中的功能进行了研究。1.实验中给家蚕注射及喂食革兰氏阴性菌绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa， P.aeruginosa）或革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）后，在不同时间点，运用半定量RT-PCR检测方法,发现脂肪体和中肠中的PGRP-S5基因转录水平明显上调，血细胞中变化较微弱。说明PGRP-S5在家蚕中受到细菌感染的调控。2.生物信息学分析显示，家蚕的PGRP-S5全长基因与棉铃虫、蓖麻蚕、烟草天蛾、果蝇、蜡螟、冈比亚按蚊及赤拟谷盗等昆虫中已发现的PGRPs的氨基酸序列及T7溶菌酶的氨基酸序列具有较高的相似性。序列比对结果显示，果蝇PGRP-LB的五个结合锌离子的酰胺酶活性位点，在家蚕PGRP-S5中都具有。3.对家蚕PGRP-S5的活性结构域进行克隆，该段cDNA全长为387bp，编码135个氨基酸。在线软件预测该蛋白等电点为5.99，理论分子量约为17kD。扩增出家蚕PGRP-S5基因活性结构域的编码序列，连接到原核表达载体pSMF再转化入大肠杆菌进行重组表达。表达的重组蛋白再经过SUMO酶酶切，可将实验所需目的蛋白PGRP-S5从融合蛋白切下。两次蛋白纯化均通过Ni-NTA亲和柱完成。4.利用得到的重组PGRP-S5活性域蛋白分别与Lys型和DAP型肽聚糖（Peptidoglycans, PG）进行结合实验，发现其对革兰氏阳性菌的DAP型PG具有较强的结合能力，而对革兰氏阳性菌的Lys型PG结合较弱或无结合，与革兰氏阴性菌的DAP型PG也无结合。PGRP-S5还对不同类型细菌产生凝集作用，进一步验证了结合特性，也说明PGRP-S5活性域与PG的结合会引发细菌的凝集。5.在Zn2+存在情况下，家蚕PGRP-S5活性域蛋白具有酰胺酶活性，可裂解B. subtilis和M. luteus的DAP型PG，但是对B. megaterium和E. coli的PG没有酰胺酶活性。并且，当有Zn2+存在时，通过平板培养实验证明家蚕PGRP-S5活性域蛋白对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌活性。6.此外，实验还发现，家蚕PGRP-S5活性域蛋白与PG的特异性结合可以激活酚氧化酶原级联反应。综上所述，家蚕PGRP-S5活性域蛋白是一个免疫相关蛋白，可作为受体来介导家蚕的酚氧化酶原级联效应，同时其具有酰胺酶活性，对细菌的生长具有抑制活性。
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