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目的肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一。临床上,HCC患者发现时往往已是晚期,治疗方法相对局限。众所周知,肝癌形成是多因素、多步骤及多中心发展的复杂过程,因此其早期诊断和治疗尤为重要。已报道的与肝癌诊断相关的标志物众多,单纯以血甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)诊断肝癌已难以满足临床需要,其敏感度和特异度均难令人满意。积累的资料证实肝癌发生发展与多种信号通路密切相关,比如最近研究较为热门的Wnt信号通路。该通路在胚胎发育和肝细胞恶性转化时可被异常激活,已有研究报道Wnt信号通路中多个关键分子如血浆分泌型卷曲蛋白1~5,Wnt1~3,Wnt3a,β-catenin等与HCC发生发展密切相关,其中Wnt3a在其他恶性肿瘤如乳腺癌,结直肠癌中均已证实呈高表达状态,但其在HCC形成过程中表达情况及其靶向治疗作用尚不清楚。本研究调查了Wnt3a在外周血及肝癌组织中的表达水平,分析对HCC诊断及预后的临床价值,并探讨敲除Wnt3a基因对Wnt信号通路及肝癌细胞增殖的影响。方法收集80例肝癌患者,53例肝硬化,53例乙肝患者和40例健康人的血清标本,酶联免疫吸附试验检测其Wnt3a表达水平及与AFP值的比较,评估血清Wnt3a临床诊断价值;免疫组织化学法及特异性抗体检测80例人肝癌组织及癌周组织Wnt3a表达,结合随访数据评估其预后价值;Crispr/cas9-sgRNA双载体慢病毒构建、感染及筛选;错配酶法在基因水平验证基因敲除效率;Western blotting在蛋白水平验证基因敲除效率及Wnt通路下游关键信号分子β-catenin的表达;Cell Counting Kit-8法检测成功敲除Wnt3a的HepG2细胞增殖活力。结果肝癌病人血Wnt3a水平显著高于良性肝病组(P<0.001),分别是肝硬化组4.02倍,慢性肝炎组9.17倍,健康对照组的26.70倍;血Wnt3a表达与AFP(P=0.005)、肝硬化(P<0.001)、HBV感染(P=0.024)、低分化(P=0.045)、TNM分期(P=0.037)和肝外转移(P=0.023)显著相关;如以800 ng/L为正常上限,对肝癌诊断的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为92.50%,94.34%,93.23%,96.10%和89.29%,与AFP联检诊断敏感度达96.25%。ROC曲线下面积Wnt3a为0.994高于AFP的0.710(P<0.001)。肝癌组织Wnt3a主要定位于细胞膜和细胞浆中,阳性率96.25%显著高于自身对照的癌周组48.75%(χ2=45.266,P<0.001);癌组Wnt3a过表达(3~6分)占71.25%,癌旁组仅为13.75%。Wnt3a高表达组与分化等级(P=0.001)、肝硬化(P=0.004)、HBV感染(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)和患者5年生存率(P<0.001)显著相关;COX分析和Kaplan–Meier生存曲线,分别显示Wnt3a过表达是HCC预后的独立预测因素及相对应的5年生存率显著降低。以Crispr/cas9-sgRNA法成功敲除人肝癌HepG2细胞中Wnt3a基因后,Wnt3a蛋白显著降低,对下游关键蛋白β-catenin有明显的下调作用,肝癌细胞增殖明显受抑,呈时间依赖性。结论Wnt3a是Wnt/β-catenin通路中的关键信号分子,它的表达是HCC诊断和预后的潜在特异标志,且有望成为肝癌基因治疗的分子靶目标。