论文部分内容阅读
目的:心肌细胞肥大(myocardial hypertrophy)是心肌细胞在各种病理因素刺激下产生的一种慢性代偿性的反应,是多种心血管事件发生时共有的病理表现,可导致心源性猝死的发病危险大大增加,在法医病理鉴定中十分常见。其发病诱因及发病机制广泛,病情发生发展的分子机制尚未十分明确。NPY(Neuropeptide Y,神经肽Y)是一种多肽,它由下丘脑分泌产生并在中枢、外周神经系统中分布广泛。NPY由36个氨基酸构成,是已知的分布在心血管系统中最广泛的神经肽。NPY参与多种心血管疾病的发生发展,与很多疾病的进展有着密不可分的关系。MicroRNA(miRNA)是由20-24个核苷酸组成的内生的小RNA,miRNA可以与特定蛋白的mRNA的3’端非编码区靶向结合,在翻译水平抑制蛋白的表达,从而参与多种生理病理过程。近年来的研究报道表明,miRNA参与心肌细胞多种生理、病理过程。本研究以体外培养的新生大鼠原代心肌细胞为研究对象,探讨miR-29a-3p在NPY诱导心肌细胞肥大过程中发挥的作用,并对NPY诱导的心肌细胞肥大的潜在分子机制进行探索,旨在为心源性猝死的法医病理鉴定和临床医学治疗提供理论依据。方法:本研究在新生大鼠原代心肌细胞上建立NPY诱导的心肌细胞肥大模型。采用联合酶(胰酶和胶原酶Ⅱ型)消化新生SD大鼠的心肌组织并分离提取原代心肌细胞,加入5-溴脱氧核苷酸(5’-BrdU)对回收的细胞悬液进行细胞纯化培养。待细胞状态稳定后,记录细胞搏动频率、观察细胞状态。提取成功的新生大鼠原代心肌细胞进行饥饿处理(1%FBS)12h,再用10nmol NPY处理细胞24h。通过鬼笔环肽(FITC Phalloidin)及α-actinin荧光染色细胞骨架来统计在NPY作用下心肌细胞表面积的变化情况,通过线粒体红色荧光探针(MitoTracker Red CMXRos)来观察线粒体形态改变。用免疫印迹法(Western blot)检测NPY处理前后动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)的蛋白表达量并分析在上调或下调miR-29a-3p后该蛋白表达量的变化,用qPCR技术定量分析心肌胚胎基因ANP的变化。结果:(1)新生SD大鼠原代心肌细胞的培养和鉴定通过混合酶法分离纯化的原代心肌细胞在72h的体外培养后,细胞波动频率趋于稳定,将提取的细胞进行cTnT(心肌肌钙蛋白)免疫荧光染色,能较好表达心肌特异性标记物cTnT的细胞则用于后续实验,并进行相关处理。即本实验所采用的细胞均为经过混合酶分离,差速贴壁培养后进行72h体外培养的原代心肌细胞。(2)NPY诱导新生SD大鼠原代心肌细胞肥大本实验室前期研究中用不同浓度的NPY(0、10、20、50、100nM)刺激新生大鼠原代心肌细胞,发现不同浓度的NPY均可刺激心肌胚胎基因ANP mRNA的增高,且当刺激时间为24h时,相对于刺激时间为48h的组别浓度依赖性较小,所以在本研究中,我们选择10nM的NPY作用24h为刺激条件。对10nM的NPY处理24h后的新生大鼠原代心肌细胞进行细胞骨架荧光染色,其结果证实NPY处理可诱导心肌细胞面积的增大。(3)NPY对线粒体功能的影响蛋白印迹结果的分析显示,当采用10nmol NPY处理原代心肌细胞24h,Drp1的表达水平与空白对照组相比上调,该上调具有统计学意义。当采用10nmol NPY处理细胞后,转染Drp1-siRNA,Drp1的蛋白表达水平可以被抑制。应用线粒体红色荧光探针(MitoTracker Red CMXRos)对心肌细胞线粒体的弱巯基进行标记。其结果显示在NPY的作用后,含线粒体碎片的线粒体明显增多。在沉默了 Drp1蛋白后,相对于单一使用NPY处理的组别观察到线粒体碎片相对变少。(4)NPY 降低 miR-29a-3p 的表达,miR-29a-3p 调节 Drp1 的表达实时荧光定量PCR结果显示,在10nmol NPY处理24h后,miR-29a-3p的表达量下降,具有统计学意义。Target scan预测分析发现Drp1的mRNA是miR-29a-3p的一个作用靶点,在新生大鼠原代心肌细胞当中,通过转染miRNA mimics上调miR-29a-3p的表达水平,结果显示Drp1蛋白表达水平降低,反之,通过转染miRNA Inhibitor下调miR-29a-3p的表达水平,结果显示Drp1蛋白表达水平升高。结论:(1)NPY诱导心肌细胞肥大并调控Drp1的高表达(2)NPY作用后miR-29a-3p表达量下降,miR-29a-3p对Drp1有负向调控作用(3)miR-29a-3p可以通过抑制Drp1的表达以缓解NPY诱导的心肌细胞肥大