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粘液表皮样癌是口腔中常见的涎腺恶性肿瘤，占涎腺恶性肿瘤30％左右，而且区域淋巴结转移率高。低分化型粘液表皮样癌的复发率高达60％～78％，患者5年生存率只有0～17％。目前临床上治疗仍以手术治疗、放射治疗和化学治疗为主。因此，有必要探索新的治疗方法。通过补充或替代体内基因的缺陷或不足治疗人类疾病的基因治疗方法，是肿瘤治疗的新途径，是当今医学研究中有前景的研究之一。由于涎腺属于外分泌腺，位置表浅，其解剖特点特别适于基因治疗。 Ohta等在1996年首先披露在人染色体3p14.2区域利用外显子捕捉法得到了一个cDNA序列长约1.1kb的新基因，该基因属于HIT(histidine triad)组氨酸三聚体超家族，编码一个16.8kDa蛋白质，且含有脆性断裂位点FRA3B，故命名为脆性组氨酸三聚体(fragile histidine triad, FHIT)。 FHIT基因在染色体上占据约1Mb大小的位置，由10个外显子(Exon)组成。其cDNA长1095bp，转录产物相应为1.1kb的mRNA。FHIT基因的5’端有一个350bp的非翻译区，3’端除亦有一个非翻译区外，还有聚腺苷酸同源序列及一个多聚腺苷酸(poly A)尾部。最开始的1～3个外显子在t(3；8)断裂处着丝粒端与PTPRG5’末端之间，FRA3B区实际上包括了整个FHIT基因位点，而最常见的断裂区域在外显子5两侧翼、内含子4，5中，跨越约200-300kb区域，在物理、化学因素的作用下，此位点易断裂缺失形成染色体缺口：HPV16整合处在外显子5’着 第四军医大学博士学位论文丝粒端。FHIT基因的外显子 5－9是开放性读框…pen reading frame，O肝卜有44 hp长，编码一个由147个氨基酸残基组成的蛋白质。 粘液表皮样癌细胞系（MECl）是本教研室建立的永生化细胞系，来源于腮腺粘液表皮样癌低分化型组织，具有高成瘤性和转移性。本研究围绕 FHIT基因在口腔恶性肿瘤细胞系 MECl细胞、舌癌 Teasll3细胞及其衍生细胞系M3，M3SP4，Tb，TbTI细胞，口底鳞癌HSC上细胞中的缺失及人正常FHIT基因转染对人粘液表皮样癌MEC八细胞体外生物学特性的影响及在裸鼠体内成瘤的抑制作用，进行了以下几个方面的工作： l．利用 TAlzol法提取 MEC－l细胞、舌癌 Teasll3细胞及其衍生细胞系＊3，＊肥… 比，比几＊沈毛细胞的总RN A，合成＊DN A，利用巢式RT－PCR方法，发现以上检测的细胞系细胞中均存在FHIT基因的异常转录本，大小分别约为MEC－l，247hP；Tcasll3，250hP；M3，503hP；M3SP4，279hp，584hp；h，496hp；TbTI，250hp，347hp，626hp；HSC－2，478hp，750 hp，1000 hp大小。DNA测序发现 MEC－豆和 Tea8113 细胞中FHIT基因的EI－ES外显子缺失。 2．利用脂质体介导法，以含人正常FHIT基因开放读框序列的真核表达载体 pRC CMVFHIT及对照质粒 pRC CMV转染人粘液表皮样癌MECl细胞，经 G4筛选，获得了稳定表达 FHIT基因的细胞克隆；通过 RTICR、兔疫组化，免疫荧光染色、Western blot检测，分别从 mRNA和蛋白分子水平证实FHIT基因已经稳定整合入粘液表皮样癌细胞的染色体基因组中，而且转染细胞中有FHIT蛋白的过表达。将稳定转染的含FHIT基因的细胞命名为MEC．FHIT，没有含FHIT基因的转染细胞命名为 MEC－RC。 3．用细胞记数法分别测得MEC－FHIT细胞、MEC－Re细胞与其未转染的亲本细胞MEC－l在体外培养条件下的生长曲线，群体倍增时间分别为24．3小时，24＊小时和25人小时。用软琼脂克隆形成法测得MEC－l，MECK。和MEC－FHIT的克隆形成率分别为17．9％，17．4％，12．3％。流式细胞仪检测细胞周期，发现FHIT基因转染后使较多的细胞滞留在GI期，S期细胞明显减少。 4．透射电镜检测MECIHIT细胞、MECKC细胞与其未转染的亲本细胞MECq 在体外培养条件下其显微结构的差异。与MECK。细胞及Detment Oforal BiolOgy CoHop OfstDmatotogu Fourth Mhtary Medhol Unthersity第4页共80页——MEC－二细胞相比，MEC－FHIT细胞间存在大量电子密度较低的丝网状结构物质，细胞表面微绒毛减少，染色质轻微边集，染色质中出现空泡，细胞发生蜕变，内质网、线粒体扩张，细胞的分泌能力增强。而MEC．Re细胞与MEC－l细胞形态相似，在结构上无显著差异。 5．裸鼠颌下腺原位移植实验显示，MEC．l细胞移植后4周瘤重1．20g士0．389，MECFHIT组瘤重0．449土0．0629，FHIT基因转染的抑瘤率为66．9％。组织病理学观察可见两组均在颌下腺形成粘液表皮样癌癌灶。MEC二组癌灶体积大，而且瘤体内实性成分多，粘液少；MEC－FHIT组癌灶的体积明显小，且瘤体内含大量粘液，实性成分很少。粘液特异性染色发现FHIT基因转染使MEC＊细胞的粘液分泌能力提高了，粘液成分在瘤体组织中的比例增加了。 上述研究结果表明，脂质体－真核表达载体基因转移系统是安全、简便、有效的基因转移系统；将人正常FHIT基因转染MEC1细胞，在体外及动物体内均能有效抑制MEC4细胞的增殖力，并能提高MECI细胞的分化程度。脂质体－真核表达载体介导人正常FHIT基因为转染?