目的:通过一般药效评价、对肠道菌群的影响等方面的研究,探讨大黄牡丹汤及其两种主要活性成分(大黄素、丹皮酚)对DSS诱导的溃疡性结肠炎(UC)的治疗作用。方法:1.大黄牡丹汤及其主要活性成分药效学评价。BALB/c小鼠分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、大黄牡丹汤三个剂量组和大黄素三个剂量组。除正常组外,其余各组小鼠自由饮用3%DSS 6天建立UC模型,造模第1天开始分别灌胃给予大黄牡丹汤和大黄素10天。第11天取材,采用小鼠疾病活动指数(DAI)评价小鼠体重、粪便性状;结肠组织切片及HE染色观察小鼠结肠病变情况;2.大黄牡丹汤及其主要活性成分对免疫细胞的影响。流式细胞术检测UC小鼠肠系膜淋巴结中T、B淋巴细胞活化情况;MTT法检测脾淋巴细胞体外增殖的影响;3.大黄牡丹汤中有效单体抗消化液稳定性实验。紫外分光光度法测定大黄素和丹皮酚体外在人工唾液、模拟胃液中的稳定性;4.大黄牡丹汤及其主要活性成分对肠道菌群结构和多样性的影响。采用16SrDNA测序法测定肠道菌群的变化情况;5.大黄牡丹汤及其主要活性成分对与UC密切相关的三种肠道细菌的影响。平板计数法测定大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚体外对两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌增殖的影响;荧光定量PCR法检测UC小鼠盲肠内容物中两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌的含量;6.大黄牡丹汤及其主要活性成分对肠道菌群代谢产物的影响。气相色谱法检测整体肠道菌群、两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌代谢产物——短链脂肪酸(SCFAs)分泌量的影响。结果:1.大黄牡丹汤及其主要活性成分对DSS所致UC小鼠的影响。BALB/c小鼠自由饮用3%DSS 6天可成功复制UC模型。除正常组外,其余各组小鼠体重、饮食量从造模第4天逐渐下降,大黄牡丹汤高剂量组小鼠体重在给药第8天后缓慢恢复;柳氮磺胺吡啶组、大黄牡丹汤各剂量组和大黄素各剂量组小鼠的饮水量、进食量于第8天后逐渐恢复。造模前5天,各组小鼠饮水情况相对稳定,饮水量从第6天开始下降,至第8天达到最低,而后逐渐上升。每天记录小鼠粪便性状和便血情况,并统计小鼠DAI,发现除正常组外,其余各组小鼠DAI自第4天明显升高,至第8天到达峰值,到第10天时,柳氮磺胺吡啶组、大黄牡丹汤中剂量组和大黄素各剂量组小鼠DAI均明显低于模型组。测量各组小鼠结直肠段长度发现,模型组小鼠结直肠水肿,明显变短,其余各给药组小鼠结直肠明显变长,且有一定的剂量依赖性。同时,取小鼠结肠进行HE染色,发现UC小鼠结肠粘膜层及粘膜下层病变严重,表现为杯状细胞大量坏死、脱落,隐窝消失,固有层肠腺明显缩小或消失,有大量炎症细胞浸润;粘膜下层间隙增大,血管扩张、充血,炎症细胞浸润;肌层明显增厚。给药后,柳氮磺胺吡啶、大黄牡丹汤和大黄素均能改善小鼠结肠炎症细胞浸润现象,肠壁变薄、粘膜层结构完整。2.大黄牡丹汤及其主要活性成分对免疫细胞的影响。观察小鼠肠系膜淋巴结中T、B淋巴细胞活化情况,发现UC小鼠T细胞活化增多,B细胞活化减少,但与正常组相比均无显著性差异。给药后,柳氮磺胺吡啶、大黄牡丹汤和大黄素均能降低肠系膜淋巴结中T、B细胞的活化程度,有一定的剂量依赖性(P<0.05或0.01)。MTT法测定大黄牡丹汤和大黄素对脾淋巴细胞体外增殖的影响,结果表明,大黄牡丹汤和大黄素能剂量依赖性抑制由ConA及LPS所致的脾淋巴细胞体外增殖,结果与LPS组、ConA组相比有显著性差异(P<0.05或0.001)。3.抗消化液稳定性实验结果表明,大黄素、丹皮酚在人工唾液、模拟胃液中可保持其吸光度的稳定。4.16SrDNA测序结果显示,体外分别给予大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚后,从门分类层面看,拟杆菌门细菌均减少,变形菌门细菌均增加,有剂量依赖性。而厚壁菌门细菌在大黄牡丹汤、大黄素体外作用下增加,而给予丹皮酚后减少;从属分类层面看,样品中含量较高的几种细菌在上述三种药物体外作用后,拟杆菌属细菌减少,乳酸杆菌属、乳球菌属增加。另外,埃希菌属、变形菌属在大黄牡丹汤、大黄素作用下有所增加,而给予丹皮酚后减少。但在对细菌种类的鉴定中,没有检测到两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌,考虑是因为这三种细菌是严格厌氧菌,在体外提取、培养的过程中,因有氧气的存在,出现损失甚至死亡。5.平板计数法检测大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚体外分别对两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌增殖的影响。结果显示:①大黄牡丹汤低浓度促进两歧双歧杆菌增殖,高浓度抑制;大黄素和丹皮酚均促进其增殖(P<0.05,0.01或0.001)。②大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚剂量依赖性地抑制脆弱拟杆菌增殖(P<0.01或0.001)。③大黄牡丹汤抑制丁酸梭菌增殖,而低浓度的大黄素和丹皮酚均促进其增殖,高浓度的大黄素和丹皮酚则抑制(P<0.05,0.01或0.001)。荧光定量PCR法观察UC小鼠盲肠内容物中两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌及丁酸梭菌的变化情况,发现模型组小鼠两歧双歧杆菌、丁酸梭菌明显减少,脆弱拟杆菌显著增多(P<0.05或P<0.001);给药后,柳氮磺胺吡啶、大黄牡丹汤和大黄素均能在一定程度上恢复两歧双歧杆菌、丁酸梭菌数量,而对脆弱拟杆菌有抑制作用(P<0.05或P<0.001)。6.采用气相色谱法检测大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚体外对肠道菌群SCFAs分泌的影响。结果如下:①整体菌群乙酸(C2):大黄牡丹汤、丹皮酚抑制整体菌群C2分泌(P<0.05,0.01或0.001);大黄素对整体菌群C2的分泌则有一定促进作用,但结果与对照组相比无显著性差异。②整体菌群丙酸(C3):肠道中C3主要由拟杆菌门细菌分泌产生,大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚均抑制整体菌群C3的分泌(P<0.05,0.01或0.001)。③整体菌群丁酸(C4):大黄牡丹汤轻微抑制整体菌群C4分泌(P<0.05或0.01),大黄素、丹皮酚不影响或促进整体菌群C4的分泌,但与对照组相比,结果均无显著性差异。但对于单独菌(两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌)SCFAs的分泌来说:①C2:大黄牡丹汤抑制三种菌C2的分泌(P<0.05,0.01或0.001);大黄素促进两歧双歧杆菌和丁酸梭菌C2的分泌,并抑制脆弱拟杆菌C2的分泌(P<0.05或0.01);丹皮酚则促进三种菌C2的分泌(P<0.05或0.01)。②C3:大黄牡丹汤、大黄素和低浓度丹皮酚则明显抑制脆弱拟杆菌C3的分泌(P<0.05或0.01)。③C4:大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚均能抑制脆弱拟杆菌丁酸的分泌,并促进丁酸梭菌丁酸的分泌(P<0.01 或 0.001)。总结来说,大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚不影响或抑制整体肠道菌群SCFAs的分泌,但能够促进两歧双歧杆菌和丁酸梭菌SCFAs的分泌,并抑制脆弱拟杆菌SCFAs的分泌。结论:1.药效学评价表明大黄牡丹汤、大黄素可改善UC小鼠疾病状态。具体表现为改善体重下降、腹泻及便血情况,明显降低小鼠DAI,改善小鼠毛发无光泽、拱背、懒动等状态,恢复小鼠活力;明显恢复UC小鼠结肠结构完整,缓解结肠充血、水肿及粘膜层炎症情况;2.大黄牡丹汤及其主要活性成分不仅能减少淋巴细胞的活化,还能抑制其增殖,表明大黄牡丹汤及其主要活性成分具有一定的免疫抑制作用;4.大黄牡丹汤及其主要活性成分可改善UC小鼠肠道菌群紊乱现象,增加两歧双歧杆菌、丁酸梭菌,并减少脆弱拟杆菌。5.大黄牡丹汤及其主要活性成分可影响肠道菌群结构、数量及代谢产物,在一定程度上可促进两歧双歧杆菌和丁酸梭菌的增殖及SCFAs的分泌功能,并抑制脆弱拟杆菌增殖及其SCFAs的分泌。