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目的:乳腺微钙化（指直径＜0.5mm的簇状钙化点）是乳腺癌诊断的一项重要影像学特征,研究显示,55%不可触及肿物的乳腺癌都伴有微钙化,而钼靶检查则是发现微钙化的主要检查方法。虽然很多证据显示,乳腺癌微钙化与HER-2过表达相关,并且提示较高的复发转移风险,但是乳腺癌微钙化形成的原因及作用机制仍不清楚。近期研究显示乳腺癌微钙化的形成可能与肿瘤细胞免疫微环境中的免疫失调以及骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）的表达异常相关。BMP-2作为转化生长因子（TGFβ）超家族中的一员,其对胚胎中乳腺组织的发育及成骨细胞分化均起着重要作用,其可以通过上调Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）促进成骨细胞分化及软骨发育成熟。因此我们猜测,在乳腺癌中,BMP-2是否也可以上调RUNX2的表达,使乳腺癌细胞具有成骨细胞特性而产生钙化。而在肿瘤组织中,其对细胞分裂,生存、迁移及分化也起着重要作用,同时BMP信号传导通路的失调可能会引起包括肿瘤在内的多种疾病发生。既往研究认为TGFβ超家族及其下游Smad2/3信号通路是调控细胞上皮-间质转化转录因子（epithelial-to-mesenchymal transitiontranscription factors,EMT-TFs）的主要途径,而其超家族成员BMPs及其下游信号Smad1/5/8虽然在很多研究中被证实与EMT相关,但关于BMPs诱导EMT机制及其是否参与调控EMT-TFs的研究甚少。我们通过TCGA数据库分析发现BMP-2与经典EMT-TFs,TWIST1表达明显正相关。研究显示BMP-2主要由肿瘤微环境中的细胞产生,而并非肿瘤细胞本身。肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociated macrophages,TAMs）作为肿瘤微环境中的主要细胞之一,其早已被证实可以分泌BMP-2,因此我们推测TAMs可释放BMP-2上调RUNX2的表达引起乳腺癌细胞微钙化,同时上调TWIST1引起EMT,导致伴微钙化患者的预后较差。本研究拟通过体内及体外实验,验证TAMs释放BMP-2通过其下游信号分别上调RUNX2及TWIST1对乳腺癌微钙化形成及其对乳腺癌生物学行为的影响,并对其相关机制进行研究,同时尝试应用BMP受体抑制剂LDN193189（LDN）抑制TAMs对乳腺癌微钙化形成及其侵袭转移的影响。研究方法:1.乳腺癌患者石蜡切片免疫组化分析:对272例来自中国医科大学附属第一医院2010年1月至2012年1月的浸润性乳腺癌患者石蜡切片进行免疫组化染色分析,包括:BMP-2、TAMs标志物（CD163及CD68）、RUNX2及TWIST1进行免疫组化分析,并结合患者钼靶检查是否伴有微钙化、预后及其他临床病理特征进行分析。2.M2型巨噬细胞的诱导及其与乳腺癌细胞共培养:THP-1细胞加入transwell板（6-孔Transwell板,0.4μm,Corning）的下室,PMA诱导24小时,LPS+IFNgamma诱导48小时,IL-4诱导48小时,流式验证诱导效果。将乳腺癌细胞加入transwell板上室,标记为共培养组;另取乳腺癌细胞加入6孔板,标记为阴性对照组（negative control,NC组）;另取共培养组细胞同时加入BMP受体抑制剂LDN,标记为共培养+抑制剂组,培养48小时进行下步实验。3.茜素红S染色:应用茜素红S染色对检测各组细胞钙沉积情况,并应用Image J软件对平均光密度值进行分析,用以比对各组细胞钙沉积差异。4.验证各组细胞蛋白变化检测:western-blot分别检测各组细胞BMP-2、Smad1/5/8、p-Smad1/5、AKT、p-AKT、RUNX2、TWIST1及EMT标志物表达;同时RT-PCR检测BMP-2、Smad5、AKT、RUNX2、TWIST1及EMT标志物表达m RNA表达水平。5.验证各组细胞功能改变:分别应用CCK-8实验、划痕愈合实验及transwell侵袭实验对各组细胞增殖、迁移及侵袭能力变化进行检测。6.体内验证TAMs释放BMP-2对乳腺癌细胞微钙化形成及侵袭转移能力的影响,并验证LDN193189对其抑制效果:将15只5周龄的BALB/c鼠随机分为三组,每组5只:（1）分别消化上述共培养组4T1细胞及M2型巨噬细胞,混合后,配制成细胞混悬液,接种至5只小鼠右侧乳房第四对脂肪垫下,标记为共培养组;（2）分别消化上述共培养组4T1细胞及M2型巨噬细胞,混合后,配制成细胞混悬液,接种至另5只小鼠右侧乳房第四对脂肪垫下,同时每日一次腹腔注射LDN（2.5mg/kg）,标记为共培养+抑制剂组;（3）消化上述NC组4T1细胞,将细胞混悬液接种至其余5只小鼠右侧乳房第四对脂肪垫下,标记为NC组。5周后,对小鼠进行PET-CT检查内脏转移情况并进行病理验证;小鼠病灶茜素红S染色及免疫组化染色验证钙化情况及蛋白表达情况。结果:1.BMP-2表达在伴微钙化的浸润性乳腺癌较不伴钙化的浸润性乳腺癌中明显升高（P=0.000）,并且微钙化及高表达的BMP-2均提示较高的复发转移风险（P=0.010及0.000）。2.CD68及CD163高表达的患者更容易伴有微钙化,P值分别为0.002及0.000。BMP-2表达与CD68及CD163表达明显正相关,P值分别为0.000及0.000,并且高表达的CD163提示较高的复发转移风险,P=0.003。3.BMP-2的表达与RUNX2及TWIST1表达显著相关,P值分别为0.004及0.005,并且RUNX2与TWIST1共同高表达提示患者预后不佳,P=0.005。4.TAMs释放BMP-2通过p-Smad及p-AKT上调MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞RUNX2的表达,引起乳腺癌微钙化的形成（P=0.0002及0.0173）,而LDN可抑制BMP-2促进微钙化形成（P=0.0005及0.0247）。5.TAMs释放BMP-2通过p-Smad及p-AKT上调乳腺癌细胞TWIST1的表达,使vimentin表达升高,促进乳腺癌EMT发生,而LDN可抑制细胞EMT的发生。通过western-blot及RT-PCR检测发现,共培养后,两组细胞的p-Smad1/5、p-AKT、TWIST1、vimentin的表达均显著升高,而Smad1/5/8,AKT及E-cadherin表达无明显变化;而加入LDN可抑制共培养组细胞p-Smad1/5、p-AKT、TWIST1及vimentin的表达。6.TAMs释放BMP-2引起乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力增强,而这一作用可被LDN所抑制。分别通过CCK-8、划痕愈合实验及transwell侵袭实验对各组细胞增城、迁移及侵袭能力检测,结果显示:共培养组较NC组增殖、迁移及侵袭能力均明显增强,而LDN可抑制其增殖、迁移及侵袭能力。7.小鼠原位转移模型显示了相似的结果,与TAMs共培养后,小鼠乳腺癌转移能力明显增强,而LDN可抑制其转移能力,同时免疫组化结果也显示了与细胞实验相似的结果。结论:1.BMP-2在伴微钙化的浸润性乳腺癌患者中表达明显升高,并且高表达的BMP-2及伴微钙化均提示较高的复发转移风险。2.乳腺癌组织中BMP-2与TAMs、RUNX2及TWIST1的表达均显著相关,并且CD163及RUNX2+TWIST1共同高表达提示患者较高的复发转移风险。3.TAMs可以释放BMP-2,通过其下游的Smad1/5/8及AKT信号上调RUNX2,促进乳腺癌微钙化的形成,而BMP受体抑制剂LDN可以抑制乳腺癌微钙化的形成。4.TAMs可以释放BMP-2通过其下游的Smad1/5/8及AKT信号上调TWIST1,促进vimentin的表达,从而引起EMT,同时促进肿瘤增殖、侵袭及转移,而这一效应可以被LDN所抑制。5.并非所有乳腺癌患者均适合应用LDN治疗,其可能只适用于TAMs聚集或BMP-2高表达的患者,而临床上,伴有微钙化的乳腺癌患者可能更适合应用LDN治疗。