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蛋白质聚乙二醇化技术可以有效地降低药物蛋白质免疫原性,延长其循环半衰期并改善其药代动力学/药效学等性质,因此成为近些年的研究热点。本论文针对具有重要临床应用价值的药物蛋白质-重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的聚乙二醇化修饰关键技术进行研究。系统考察不同端基、不同分子量聚乙二醇修饰剂对于rhG-CSF的修饰、分离纯化、理化性质表征、稳定性以及体内外活性影响。针对聚乙二醇偶联物中游离PEG难以检测的问题,提出SDS-PAGE碘化钡染色的方法同时分离检测并定量游离PEG；针对聚乙二醇.蛋白质偶联物分子尺寸较大这一特点,制备新型色谱介质进行分离纯化的研究。获得的具体成果如下:
1.PEG-蛋白质的理化性质和药效学性质取决于蛋白质和聚合物的性质以及所采用的偶联基团。因此,论文首先采用三种端基不同的聚乙二醇修饰剂:琥珀酰亚胺碳酸酯-单甲氧基聚乙二醇(SC-mPEG)、丙醛-单甲氧基聚乙二醇(ALD-mPEG)、马来酰亚胺-单甲氧基聚乙二醇(MAL-mPEG)分别对rhG—CSF的N末端氨基和游离巯基进行修饰研究,考察修饰反应过程、修饰产物的理化性质、修饰产物体外细胞活性以及体外稳定性。实验结果表明,rhG-CSF采用ALD-mPEG修饰所得产物,具有最高的修饰反应产率、最高的体外活性和体外稳定性。
2.以PEG丙醛(ALD-PEG)为修饰剂,从修饰产物制备、理化性质表征、体内外活性角度考察不同分子量的ALD-PEG对于rhG—CSF的修饰结果。结果表明,采用30 kDa ALD-PEG修饰rhG-CSF所获得N末端的定点单修饰产物,具有较高的体外活性保留(65％)、最长的体内循环半衰期以及最高的药物生物利用度。在此基础上,进行了PEG30-GCSF三批中试制备放大实验,结果表明,所建立的修饰、分离纯化工艺较为稳定,各批次单修饰产物PEG30-GCSF重复性好,为药物报批及临床研究打下坚实基础。
3.为解决PEG-蛋白质偶联物中游离PEG检测的问题,提出并建立RP-ELSD以及SDS-PAGE碘化钡染色两种方法,用于检测PEG-蛋白质偶联物中游离PEG。比较分析研究了RP-ELSD和SDS-PAGE对于不同分子量PEG-蛋白质和游离PEG(10,20,30 kDa)的分离度、检测灵敏度、定量限、准确性等。研究结果表明,SDS—PAGE碘化钡染色(SDS-PAGE-BIS)能够有效分离并应用于PEG-蛋白质偶联物中游离PEG的检测和定量分析研究,具有较高的灵敏度。RP-ELSD在一定条件下能够有效分离PEG-蛋白质偶联物以及游离PEG,但是其检测灵敏度随着聚乙二醇分子量的增加而降低。
4.为了克服现有商品化离子交换介质分离PEG-蛋白质偶联物时存在的不足,制备了新型的超大孔离子交换SP-AP介质,并将其应用于PEG30-GCSF修饰反应混合物的分离纯化。实验结果表明,超大孔SP-AP介质在较高流速下(1224 cm/h)仍然能够有效分离PEG30-GCSF修饰反应混合物；在流速306 cm/h时,PEG30-GCSF载量高于10 mg/ml。采用激光共聚焦显微镜动态观测色谱介质孔内的传质,结果表明,PEG30-GCSF在SP-AP介质孔内传质速度较快,5 min之内即可以从介质表面扩散到微球内部；而在吸附60 min后仍未能进入商品化介质的孔内部。这说明,SP-AP介质的大孔结构增强了大尺寸溶质分子PEG-蛋白质偶联物的在色谱介质内部的对流传质和扩散传质,使得PEG-蛋白质偶联物的分离可以在较高流速下进行,并且分离效果优于商品化介质的结果,有望成为一种用于PEG-蛋白质偶联物以及其它高分子蛋白质、抗体以及疫苗的高载量、高效分离纯化介质。