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骨质疏松症(osteoporosis)是全身性骨骼疾病,其特征是骨强度下降、骨折风险性增加。有效的治疗骨质疏松症,预防骨质疏松性骨折的发生,成为医学界关注的问题。而药物治疗是治疗骨质疏松症的主要手段,近年来有关中药治疗骨质疏松症的报道较多,但作用机理不详。我们从众多传统上认为具有骨质疏松症疗效的中药中,利用现代分子生物学的技术筛选到了一种具有成骨刺激作用的中药石斛。石斛是常用名贵中药材,为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)多种植物的新鲜或干燥茎的统称。在我国传统医学中,石斛的药用历史悠久,现代药理学研究表明,石斛具有滋阴清热和生津作用、抗肿瘤活性、免疫调节作用、对糖尿病的治疗作用、扩张血管作用、抗氧化活性、防治白内障、抗炎等作用。
本实验旨在分离石斛提取物中的各种成分,通过其体内及体外实验检测来寻找石斛中具有成骨刺激作用的有效组分。
第一部分实验旨在对石斛有效成分进行提取和分离,为后续的体内及体外刺激实验做好准备。本文通过三种提取方法对中药石斛进行提取,并探讨了它们的提取效率,进而采用有机溶剂分级萃取和离子交换柱层析对提取物进行了粗分离。
第二部分实验是在体内、体外证实了石斛水溶性组分的刺激成骨作用,体外实验是利用成骨信号通路Bmp-2/Smad反应元件12×SBE的稳定转染细胞株C2C12-T9,作为筛选具有成骨作用药物组分的工具。通过用石斛水提取物刺激该细胞系,发现石斛水提取物可以激活BMP-2/Smad信号通路;体内实验是用小鼠顶骨异位成骨实验来证实石斛水提取物具有成骨作用。
第三部分实验通过检测不同提取方法分离到的石斛提取物刺激稳定转染细胞株C2C12-T9,并检测其对成骨标志性基因Osteocalcin、Ⅰ型胶原表达的作用,进一步确证了石斛水提取物的刺激成骨作用。经过综合分析,我们推测其中的多糖组分是成骨效应关键物质。