论文部分内容阅读
目的:利拉鲁肽是目前治疗2型糖尿病的新上市降糖药物,不仅可以促进胰岛素分泌,还可增加胰腺外组织对胰岛素作用的敏感性。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病及代谢综合征的发病机制之一。既往有研究发现利拉鲁肽可改善IR,但具体机制尚未明确。本实验通过使用不同浓度的利拉鲁肽对高脂饲料喂养的大鼠进行干预,观察其在IR大鼠肝脏的脂质沉积以及对胰岛素的敏感性的影响;本研究经检测肝脏内质网应激分子伴侣GRP78,内质网应激相关分子JNK,胰岛素信号传导通路相关分子GLUT-2、AKT表达的情况,探究利拉鲁肽改善IR,减少肝脏脂肪沉积的机制,为其在临床的应用提供理论支持。方法:Wistar雄性4月龄大鼠,体重250g左右,54只,经过3天适应性的喂养,随机将其分为对照组(NC,n=16)和高脂组(n=38),分别以普通和高脂饲料喂养。8周末,两组在随机下取5只大鼠在其清醒状态下进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验,然后计算两组大鼠的葡萄糖输注率(glu cose infusion rate,GIR),判定其IR状态。判定造模成功后,将高脂大鼠分为三组即高脂对照组(HFD)、利拉鲁肽低剂量组(LL)、利拉鲁肽高剂量组(HL),每组11只。分别以0.5ml的灭菌生理盐水对NC组及HFD组进行皮下注射;以100ug/kg的利拉鲁肽对LL组日一次进行皮下注射;以200ug/kg的利拉鲁肽对HL组日一次行皮下注射。药物干预2周后,四组分别随机选取5只大鼠,后进行口服糖耐量(oral glucose tolerance test,OGTT)实验和钳夹试验,以算出大鼠葡萄糖曲线下面积(Area Un der Curve,AUC)及GIR。对各个组中剩余的6只大鼠分别称体重(body weight,BW),然后进行麻醉,腹主动脉取血,-80℃保存,测定甘油三酯(triglyceride,TG)、游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、总胆固醇(tot al cholesterol,TCH)以及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein c holesterol,LDL-C)、肝转氨酶学改变。分别制作肝脏标本并保存,测定肝组织甘油三酯(LTG),经透电子显微镜察看肝细胞内质网结构是否发生改变,应用Western blot技术对肝脏中GRP78、GLUT-2、p-AKT、p-JN K蛋白表达情况进行检测,应用Realtime-PCR对GRP78、GLUT-2 m RNA表达情况进行测定。结果:1四组大鼠一般情况的比较与NC组相较,HFD组中BW、血FFA以及LTG均显著增高(P<0.05)。与HFD组相比较,HL组中BW、血FFA、TG、LTG、肝转氨酶学指标均显著降低(P<0.05);LL组中仅有FFA、肝转氨酶学指标的下降(P<0.05)。与LL组相比,HL组血液指标均有明显改善,血FFA、TG、LTG也均有显著减少(P<0.05)2四组大鼠GIR的比较喂养第8周时,高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验结果示:与NC组相比,HFD组葡萄糖输注率GIR下降(30.21±2.51vs20.41±3.64mg/kg.min)(P<0.05)。药物干预2周后,与HFD组相比,HL组GIR升高(18.83±1.95)vs(25.80±1.40)mg/kg.min(P<0.05),LL组GIR升高(18.83±1.95)vs(21.55±2.46)mg/kg.min(P<0.05);与LL组相比,HL组GIR亦升高(21.55±2.46)vs(25.80±1.40)mg/kg.min(P<0.05)。3四组大鼠OGTT的比较与NC组相比较,HFD组大鼠血糖及葡萄糖曲线下面积AUC于0min、30min、60min、120min四个点处均显著升高(P<0.05);与HFD组相比较,HL组大鼠血糖及AUC在四个点处均降低(P<0.05),LL组大鼠虽四个点处血糖及AUC均有所降低,然而仅在120min时血糖变化有显著性差异(P<0.05);与LL组相比较,HL组大鼠血糖及AUC于0min、120min两个点处均显著降低(P<0.05)。4四组大鼠肝脏形态学变化(光学显微镜)在NC组中,肝细胞细胞壁及内部细胞器结构完整,肝小叶和中央静脉结构正常,可在中央静脉周围清晰观察到呈放射状排布的肝细胞索,HFD组肝细胞体积显著扩大,胞内存在大小不等的脂滴,细胞核移向细胞边缘,LL组肝细胞体积有所减小,胞内脂滴数目减少,体积缩小,HL组大鼠的肝细胞排列规整,胞内可见少量脂滴,其肝小叶及肝索结构完整。5四组大鼠肝细胞内质网变化(透射电子显微镜)与NC组相比,HFD组肝细胞核周围脂滴数量多,体积大,内质网明显扩张,脱颗粒明显;与HFD组相比,LL组肝细胞内质网轻度扩张,脱颗粒轻微缓解;与HFD组相比,HL组肝细胞核周围无明显脂滴存在,内质网扩张及脱颗粒得到显著缓解。6四组大鼠肝脏GRP78、GLUT-2 m RNA表达水平比较与NC组大鼠相比较,HFD组大鼠的GRP78 m RNA的表达显著增高,GLUT-2 m RNA表达显著减低(P<0.05);与HFD组大鼠相比较,LL组及HL组大鼠GRP78 m RNA的表达均显著降低(P<0.05),与LL组大鼠相比较,HL组减低更为明显(P<0.05);与HFD组大鼠相比较,LL组及HL组GLUT-2 m RNA的表达均显著上调(P<0.05),但HL组上调程度显著高于LL组(P<0.05)。7四组大鼠肝GRP78、GLUT-2、p-AKT和p-JNK蛋白表达水平比较与NC组相比,HFD组GRP78蛋白表达上调,GLUT-2蛋白表达下调,磷酸化JNK(p-JNK)/JNK明显升高,磷酸化AKT(p-AKT)/AKT明显下降(P<0.05)。与HFD组相比,HL组、LL组GRP78蛋白表达均下调,GLUT-2蛋白表达均上调,p-JNK/JNK均下降,p-AKT/AKT均升高(P<0.05)。与LL组相比,HL组GRP78蛋白表达下调,GLUT-2蛋白表达上调,p-JNK/JNK下降,p-AKT/AKT增加(P<0.05)。8相关分析研究结果:GIR与BW,血FFA、TG及LTG呈负相关(P<0.05或P<0.01)。GRP78蛋白表达量与血FFA、TG,LTG呈正相关(P<0.05或P<0.01),同时与GIR呈负相关(P<0.01)。GLUT-2蛋白表达量与血FFA、TG,LTG呈负相关(P<0.01),并且与GIR呈正相关(P<0.01)。JNK磷酸化水平与血FFA、TG,LTG呈正相关(P<0.01),且与GIR呈负相关(P<0.01)。AKT磷酸化水平与与血FFA、TG,LTG呈负相关(P<0.05或P<0.01),且与GIR呈正相关(P<0.01)。结论:1高脂饮食可使大鼠出现糖脂代谢紊乱,并增加肝脏脂肪沉积,出现糖耐量的降低及IR。2利拉鲁肽对改善糖脂代谢紊乱、减少肝脏脂质蓄积以及改善IR和糖耐量减低呈浓度依赖性。3利拉鲁肽呈浓度依赖性对GRP78/JNK/AKT/GLUT-2通路进行调控,与缓解肝脏内质网应激,减少肝脏脂质沉积,促进肝细胞对葡萄糖摄取,改善IR相关。