第一部分 基于iTRAQ-2DLC-MS/MS技术的肺结核病证候特异性蛋白质的筛选及其临床病理分析研究背景：肺结核病(pulmonary tuberculosis, TB)是单一感染因素引起死亡人数最多的传染病。目前,肺结核病的治疗以西医治疗为主,以常规西医抗结核方案治疗方法用药6个月。这种治疗方法,易产生耐药性肺结核和药物毒副作用,如异烟肼、利福平和吡嗪酰胺均具有严重的肝毒性,严重者可以导致肝功能衰竭或患者死亡。因此,部分患者不得不中断治疗,增加了肺结核复发,以及耐药肺结核病的产生。中医将肺结核病分为肺阴虚证(pulmonary Yin deficiency syndrome, PYD)、阴虚火旺证(hyperactivity of fire due to Yin deficiency syndrome, HFYD)、气阴两虚证(deficiency of Qi and Yin syndrome, DQY)和阴阳两虚证(deficiency of Yin and Yang syndrome, DYY)四证。根据不同证候采用不同的方药治疗,对抑制结核分枝杆菌、提高机体免疫、降低西医抗结核药物毒副作用、减轻肺结核中毒症状等具有较好的疗效。但由于中医证候分型受中医师的临床经验、学识等主观因素影响较大,且缺乏相应的科学基础研究,缺乏客观的检测方法。因此,极大地影响了中西医结合治疗肺结核病的临床应用。研究方法：根据中医辨证,将肺结核病患者分为肺阴虚证、阴虚火旺证、气阴两虚证和阴阳两虚证四证。采集214例肺结核病患者血清,采用生物信息学方法分析肺结核中医证候的临床病理特点和证候转归规律；采用iTRAQ稳定同位素标记,联合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)技术筛选并鉴定肺结核中医证候的血清差异蛋白质；再通过扩大样本量,通过ELISA法进行验证。此外,本实验3年内仅收集到5例阴阳两虚证证患者,样本量不足以纳入后续实验。研究结果：本实验发现肺结核病肺阴虚证患者以结核结节、条索、斑片状影等增生性病变为主；阴虚火旺证患者以空洞、干酪样坏死等变质性病变为主,变质性病变发生率显著升高(P=0.0427)；气阴两虚证患者以重症肺结核病为主,具有多种肺部损伤,患者粟粒性病变发生率显著升高(P=0.0013),此外,气阴两虚证患者血沉值显著高于肺阴虚和阴虚火旺证患者(P=0.0178)。治疗后,36例治愈患者中,94.44%的初治肺结核病患者(12例肺阴虚证、18例阴虚火旺证、4例气阴两虚证)向肺阴虚证转归,且患者血沉显著下降,病灶明显吸收,空洞闭合。蛋白质组学研究结果表明,共有39个差异蛋白质在肺结核证候之间表现出显著差异。临床大样本验证结果显示,γ-谷氨酰水解酶(GGH)、IgG3恒定区(IGHG3)触珠蛋白(HPT)分别在肺结核病肺阴虚证、阴虚火旺证、气阴两虚证中特异性高表达(P<0.01,P<0.001,P<0.01)。并且,肺阴虚证患者GGH含量显著高于阴虚火旺证和气阴两虚证(P<0.01,P<0.001),阴虚火旺证患者IGHG3含量显著高于肺阴虚证和气阴两虚证(P<0.001,P<0.01)。结论：(1)通过生物信息学分析,发现肺结核病证候与患者病理变化和血沉密切相关。(2)通过iTRAQ-2DLC-MS/MS技术和ELISA验证,获得了GGH、IGHG3和HPT分别为肺结核证肺阴虚证、阴虚火旺证、气阴两虚证的血清特异性蛋白质。(3)本实验为肺结核病中医证候提供了新生物学研究基础,为肺结核病证候的病理改变提供了实验依据。第二部分 基于iTRAQ-2DLC-MS/MS技术的肺结核病潜在蛋白质标志物研究研究背景：肺结核病(pulmonary tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的慢性传染病,随着HIV合并肺结核病和耐多药肺结核病的产生,肺结核病对人类健康带来了极大威胁。中国是肺结核病负担最重的国家之一,位居全球第2位。肺结核病诊断的延迟可能会使疾病的严重程度、死亡率和传染风险增加。因此,早发现、早诊断、早治疗,是控制肺结核病传播的重要因素,是遏制肺结核病流行趋势的主要手段。临床上,肺结核病的诊断主要依赖痰涂、痰培养、胸透(X-ray/CT)和临床症候学等方法,痰涂检测阳性率低下,痰培养检查耗时太长,胸透(X-ray/CT)和临床症候学诊断方法特异性差,易与肺炎、慢性阻塞性肺炎(COPD)等肺部疾病混淆。寻找快速、高效的肺结核病诊断标志物已成为控制肺结核病的研究重点。研究方法：本实验共纳入423例受试者。其中,初治活动性肺结核病患者138例,健康献血者67例,肺炎患者73例,COPD患者73例,治疗后肺结核病患者72例。采用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术比较初治肺结核病、正常人、肺炎、COPD患者的蛋白质组学差异,筛选和鉴定初治肺结核病的血清差异蛋白质,并用ELISA法进行大样本验证。采用生物信息学方法分析患者的临床检测特征,分析特异性蛋白质与临床检测结果的相关性。并通过逻辑回归分析,建立蛋白质诊断模型,通过ROC曲线法分析该蛋白质模型的准确性、特异性和灵敏度。研究结果：通过与正常人比较,获得了79个肺结核病显著差异蛋白质,其中47个蛋白质同时还与肺炎、COPD患者有显著差异。初治肺结核病患者(n=138)血清淀粉样蛋白A (SAA)、维生素K依赖蛋白Z (PROZ)、补体C4b结合蛋白质β链(C4BPB)含量均显著高于正常人(n=67)(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001),显著低于肺炎患者(n=73)(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001)和COPD患者(n=73)(P<0.0001,P<0.0001,P=0.0016)。6个月治疗后,治疗后肺结核病患者(n=72)SAA和PROZ含量显著升高(P=0.022,P<0.0001),C4BPB含量显著降低(P=0.0038),但仍与正常人有显著差异(P<0.0001)。还发现,空洞型肺结核病患者SAA和PROZ含量显著高于非空洞患者(P=0.006,P=0.03),双肺损伤的肺结核病患者SAA含量显著高于单肺损伤患者(P=0.003),痰涂阳性患者SAA含量显著高于痰涂阴性患者(P=0.02)。临床分析结果显示初治肺结核病患者许多凝血指标和血脂指标均与正常人、肺炎、COPD、治疗后TB有显著差异(P<0.05)。相关性分析显示,初治TB患者PROZ与国际标准化比率(INR)有显著相关性(rs=0.414, P=0.044), C4BPB与血浆纤维蛋白原(FIB)有显著相关性(rs=0.617,P=0.0002)。受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve, ROC)曲线分析结果显示SAA.PROZ和C4BPB组成的诊断模型,从正常人、肺炎、COPD和治疗后肺结核病患者中诊断初治肺结核病的曲线下面积(Area under the ROC curve, AUC)值分别为0.971、0.895、0.895和0.872。结论：(1)本实验通过iTRAQ-2DLC-MS/MS和ELISA技术获得了3个初治肺结核病潜在诊断标志物(SAA、PROZ和C4BPB)。(2)由SAA、PROZ和C4BPB组成的蛋白质模型从正常人、肺炎、COPD和治疗后肺结核病患者中诊断初治肺结核病具有良好效果,其AUC值分别为0.971、0.895、0.895和0.872。(3)通过生物信息学分析,发现初治肺结核病患者临床凝血检测结果异常,发现特异性蛋白质PROZ与凝血检测指标INR存在显著正相关,C4BPB与FIB存在显著正相关。但是PROZ和C4BPB具体如何参与肺结核病患者的凝血异常还有待下一步研究。