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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道疾病为临床特征的病毒性传染病。由于PRRSV具有免疫抑制和持续感染的特性,给我国乃至世界养猪业造成了严重的经济损失。然而PRRSV感染诱导免疫抑制的分子机制至今尚未完全解析,因此从病毒和宿主细胞等不同角度探讨其免疫抑制的原因成为本研究的目标。本研究以遗传背景清晰的高致病性PRRSV强毒株HuN4和弱毒株HuN4-F112为研究对象,分析强、弱毒株对I型IFN表达的影响因素。将强毒株HuN4和弱毒株HuN4-F112感染Marc-145细胞后,用相对RT-PCR检测IFN-βmRNA水平,结果显示强毒株HuN4诱导IFN-βmRAN水平明显低于弱毒株HuN4-F112,为探究强、弱毒株诱导IFN-β表达差异的原因,分别构建了两毒株的NSPs真核表达载体,并用双荧光素酶检测系统检测NSPs对IFN-β启动子转录活性的影响,结果显示HuN4和HuN4-F112的NSP1α,NSP1β,NSP2,NSP4和NSP12均抑制IFN-β启动子转录活性,但上述非结构蛋白抑制IFN-β表达的能力在强、弱毒株间差异并不显著,推测体外单独过表达NSPs与病毒在感染细胞中NSPs存在形式及相互协调功能的差异造成的。同时,与此前研究不同,本研究中我们证实PRRSV HuN4和HuN4-F112的NSP12对IFN-β表达也具有明显抑制作用,进一步检测不同剂量NSP12对IFN-β表达的影响,结果显示NSP12对IFN-β的转录抑制作用呈剂量依赖性。先天免疫中RIG-I信号通路在抑制RNA病毒具有重要的作用,为了深入探究NSP12的作用途径,NSP12和RIG-I信号通路中重要蛋白分子RIG-I,VISA,IKKβ,IKKε,以及IRF3和NF-κB顺势作用原件共转染,用双荧光素系统检IFN-β启动子转录活性,结果显示共转染NSP12的相对荧光值与阳性对照无明显差异,证实PRRSV的NSP12蛋白并非通过抑制RIG-I通路的活化及IRF3和NF-κB的活性来抑制IFN-β的表达,然而NSP12抑制I-IFN的表达的机制还需要通过进一步试验来进行验证。PRRSV作为免疫抑制病毒不仅能够抑制I型干扰素的表达,还可上调表达IL-10,而IL-10的转录需CREB与CBP结合,而NF-κB依赖的I-IFN转录也需要p65与CBP的结合,但细胞内有限数量CBP的结合动向尚未得知。为探究IL-10转录因子CREB活性、活化通路及与CBP结合情况,本研究我们利用强毒株HuN4感染细胞,通过CoIP,Western blot等实验进行分析。结果显示HuN4株感染引起的CREB活化具有细胞特异性,Marc-145细胞感染HuN4株后p38磷酸化水平显著上调,利用抑制剂抑制PKA活性则CREB磷酸化受到明显抑制;将HuN4感染PAMs后可见p38磷酸化水平显著上调,而抑制PKA通路却不影响CREB的磷酸化水平。CoIP实验结果显示PRRSV感染1h后磷酸化的CREB能够与CBP结合,抑制hTNF-α刺激产生的磷酸化p65与CBP的结合;而抑制CREB磷酸化后,CREB与CBP的结合则受到抑制。本研究证实细胞感染高致病性PRRSV HuN4株后,可通过激活p38 MAPK通路活化CREB,活化的CREB与CBP的竞争结合抑制了p65与CBP的结合,从而在PRRSV感染初期抑制了I-IFN转录的启动活性。上述研究结果为我们深入解析PRRSV对先天免疫抑制的分子机制提供了新的理论依据。