目的:妊娠期中药的应用存在一定的普遍性。川芎是妊娠期使用频次较高的20味中药之一,目前尚未见有研究对川芎的胚胎毒性作出评价,因此,为保证川芎在妊娠期安全合理使用,需对川芎胚胎毒性进行系统研究。本课题根据胚胎毒性评价指导原则,通过体内实验（小鼠胚胎-胎仔毒性和致畸性试验,SegmentⅡ试验）对川芎的胚胎毒性进行评价,以及通过体外替代试验,利用小鼠胚胎干细胞实验模型,从细胞毒性和抑制分化的角度,对川芎的胚胎毒性进行等级评价。预实验中发现,高剂量川芎水煎液对胎鼠骨骼有一定的致畸作用,利用小鼠胚胎干细胞的多能性,定向诱导分化成骨细胞,从骨代谢角度,初步探讨川芎胚胎毒性的分子机制。方法:1.川芎的质量研究:依2015版《中国药典》规定,对川芎饮片和川芎水煎液中阿魏酸含量进行测定。采用气相色谱法测定部分有机氯、有机磷和拟除虫菊酯类农药含量。采用原子吸收分光光度法测定铅、镉、砷、汞、铜等重金属含量。确保实验所用川芎的质量符合该课题研究标准。2.胚胎-胎仔毒性和致畸性试验:以昆明小鼠为实验对象,在小鼠孕第6～15d灌胃给予川芎水煎液高、中、低（32、8、2g/kg/d）剂量,阴性对照组给予等剂量蒸馏水,阳性对照组在孕第7、9、11d给予200000IU/kg维生素A溶液,孕18d处死动物。实验期间记录母体体重,并观察体重变化和母体毒性体征,处死动物后,对母体子宫、心脏、肝脏和肾脏进行称重,并对心、肝、肾做病理切片观察,评价各组药物对母体的影响。对胎仔影响的评价包括:死胎数、活胎数、吸收胎数以及外观、内脏畸形和骨骼畸形。通过体内实验,评价各组药物对妊娠小鼠的胚胎发育毒性。3.利用小鼠胚胎干细胞实验模型评价川芎胚胎毒性:体外培养小鼠胚胎干细胞D3（ES-D3）和小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）,通过MTT法检测细胞毒性,得到半数抑制增殖浓度IC50（D3）和IC50（3T3）。在撤除白血病抑制因子（LIF）的条件下,小鼠胚胎干细胞自发分化成心肌细胞,采用定时定量PCR（q-PCR）检测心肌细胞中所含特异性肌球蛋白重链基因（β-MHC）的表达,得到半数抑制分化浓度ID50（D3）。并用已知胚胎毒性（强、弱、无）的三种药物验证已建立的胚胎干细胞实验模型的有效性。最终利用发育毒性计算公式,判断川芎水煎液的胚胎毒性等级。4.基于BMP-Smad信号通路初步探讨川芎胚胎毒性分子机制:小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞。分化过程中,对诱导剂的浓度进行筛选,于分化第7、14、21、28d检测细胞中ALP活力,第22d茜素红染色鉴定,计算成骨细胞诱导形成率,并采用q-PCR检测不同诱导方案的成骨关键基因的表达情况,最终筛选出最佳诱导成骨细胞的方案。在成功诱导成骨细胞的基础上给予不同浓度梯度的川芎水煎液,于给药的第3、6、9d采用q-PCR法检测BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5等成骨相关关键基因的表达。最终通过统计学分析初步解释川芎水煎液胚胎毒性的分子机制。结果:1.川芎中阿魏酸含量为0.15%（药典规定不少于0.1%）,符合《中国药典》质量要求。铅、镉等重金属及农药残留均不超标。2.体内胚胎-胎仔毒性和致畸性试验结果显示,各剂量川芎水煎液对母体体重和子宫重量均无显著性影响。母体心、肝、肾的病理切片显示各组肾和心未见异常变化;高、中剂量川芎水煎液对母体肝细胞有一定程度的损害。对胎鼠的观察结果显示,高剂量川芎水煎液使胎鼠吸收胎数显著增加（P<0.05）。且高剂量组胎鼠上枕骨发育异常,部分趾骨缺失,胸骨发育异常。体内动物实验结果表明,川芎水煎液具有潜在的胚胎毒性。3.建立小鼠胚胎干细胞实验模型,结果显示Penicillin G无胚胎发育毒性,DPH为弱胚胎发育毒性,5FU为强胚胎发育毒性,与参考文献一致,证实模型有效。通过该模型,得到川芎的IC503T3为9.39mg/m L,IC50D3为18.78mg/m L,ID50D3为10.19mg/m L。带入EST线性判别公式得出,川芎为弱胚胎发育毒性。4.小鼠胚胎干细胞体外定向诱导成骨细胞,当诱导剂为50μg/m L维生素C+50mmol/Lβ-磷酸甘油+1μmol/L地塞米松时成骨细胞诱导形成率最高,达到29.12%。在给药不同时间点检测不同浓度川芎水煎液对成骨关键基因表达水平的影响,结果显示不同时间点BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5表达水平均随川芎水煎液浓度增加而下调。结论:1、高剂量组川芎水煎液可使小鼠胎仔吸收胎数显著性增加,对胎鼠骨骼发育有一定程度影响。提示川芎水煎液具有潜在的胚胎毒性,且川芎水煎液对妊娠小鼠的影响可能与剂量相关。2、小鼠胚胎干细胞实验显示川芎水煎液具有弱胚胎毒性。3、川芎水煎液的胚胎毒性机制可能与影响BMP-Smads信号通路中关键基因的表达有关。