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第一部分Ti颗粒对成骨样细胞MC3T3-E1的毒性试验目的 验证所使用的Ti颗粒对成骨样细胞的细胞毒性。明确用于后续实验合适的Ti颗粒浓度方法 不同浓度Ti颗粒0,10,50,100,1000(Ti颗粒数/细胞数;分别命名为Ti-0,Ti-10,Ti-50,Ti-100,Ti-1000组)与MC3T3-E1细胞共同培养,48小时后观察Ti颗粒被MC3T3-E1细胞的吞噬情况,采用CCK8试剂盒测定不同浓度Ti钛颗粒对MC3T3-E1细胞的细胞毒性。14天后,采用茜素红染色观察矿化结节,并用氯化十六烷基吡啶进行半定量分析。采用ALP试剂盒,测定Ti颗粒对MC3T3-E1细胞ALP分泌的影响;Real Time-PCR测定Col1α1,IL-6的表达;结果 MC3T3-E1细胞与Ti颗粒共培养48小时,可见Ti颗粒明显被细胞吞噬。随着Ti颗粒浓度的增加,Ti颗粒对成骨细胞的毒性逐渐增加,Ti-1000时,MC3T3-E1细胞的细胞活性仅为对照组Ti-0组的28.3%;14天后茜素红染色及半定量分析结果显示,随着Ti颗粒浓度的升高,MC3T3-E1细胞的矿化逐渐增加,在Ti-100达到高峰,当Ti-1000时,MC3T3-E1细胞的矿化降低。Real-Time PCR显示Ti-100,Ti-1000均显著抑制了MC3T3-E1细胞Col1α1的表达,但Ti-1000对IL-6的表达也出现抑制趋势。共培养7天,ALP活性结果显示Ti-100在第7天和第14天均显著抑制了MC3T3-E1细胞的ALP活性;结论 本课题选用的Ti颗粒可有效地被MC3T3-E1细胞吞噬,随着Ti颗粒浓度的升高,Ti颗粒的毒性逐渐增加;对于细胞的分化,Ti颗粒浓度达到Ti-100时,明显抑制了成骨样细胞的功能,但同时不至于严重影响细胞的活性。对于细胞的矿化,Ti颗粒并没有抑制成骨样细胞的矿化,反而具有促进作用,这可能是由于细胞外未被吞噬的Ti颗粒提供的粗糙面粘附了较多的纤维蛋白导致,而与成骨细胞的功能和活性可能无关。第二部分低剂量X线照射对Ti颗粒刺激后MC3T3-E1细胞的影响目的 明确LDI是否会加重Ti颗粒对成骨样细胞的影响;明确在Ti颗粒存在情况下,LDI是否能够促进成骨样细胞的分化;明确LDI对Ti颗粒刺激后成骨样细胞IL-6表达的影响方法 不同浓度Ti颗粒与MC3T3-E1细胞共同培养,24小时后接受0.5 Gy X线照射,照射后24小时、48小时、72小时后采用CCK8试剂盒测定MC3T3-E1细胞的活性。照射后3天、7天后采用ELISA法测定上清液中PICP的浓度;照射后7天、14天采用ALP试剂盒测定细胞裂解液的ALP活性;照射后5天,提取细胞内总RNA,反转录,行Real-Time PCR对IL-6基因的表达进行相对定量分析。照射后14天采用茜素红染色观察MC3T3-E1细胞的矿化并采用氯化十六烷基吡啶进行半定量分析。结果 Ti颗粒在24小时、48小时、72小时,对MC3T3-E1细胞的活性均有显著地抑制效应。照射后24小时,LDI对细胞的活性没有显著影响,但是48小时和72小时后,LDI对MC3T3-E1细胞的活性也出现抑制效应,同时会加重Ti颗粒的影响。照射后3天,Ti-100组PICP的浓度显著下降,在第7天时仍有明显差异。LDI,在照射后3天对PICP浓度的影响没有统计学差异,但第7天时,LDI照射后,各组PICP的浓度都有升高趋势,双因素方差分析显示差异具有统计学意义。ALP碱性磷酸酶活性检测显示照射后7天,Ti颗粒因素对MC3T3-E1细胞的ALP活性影响具有统计学差异,但照射因素对ALP活性的影响没有统计学差异。照射后14天,Ti颗粒因素对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响仍然存在,Ti颗粒各浓度组,照射后细胞的ALP活性均高于假照射组,差异具有统计学意义。Real-Time PCR结果显示LDI可有效降低Ti颗粒刺激后MC3T3-E1细胞IL-6的表达。茜素红染色显示在Ti颗粒存在的情况下LDI仍具有促进矿化的效应。结论 LDI早期会加重Ti颗粒对成骨样对细胞增殖的影响,但LDI不会加重Ti颗粒对成骨样细胞分化的影响,反而在Ti颗粒存在的情况下仍具有促进成骨样细胞分化、矿化的作用,同时LDI可下调Ti颗粒刺激后成骨样细胞IL-6的表达。第三部分低剂量X线照射与Ti颗粒对兔股骨远端植入假体骨整合的影响目的 明确LDI对兔股骨远端植入假体骨整合的影响,及对Ti颗粒注射后兔股骨远端植入假体骨整合的影响方法 将20只新西兰白兔随机分为照射组与对照组,每组动物建立假体植入模型,右膝注入0.2ml生理盐水,左膝注入0.2ml Ti颗粒悬液模拟磨损颗粒。最终动物模型根据处理方式的不同分为四组,分别为0Gy-NS:注射生理盐水假照射组;0Gy-Ti:注射Ti颗粒悬液假照射组;0.5Gy-NS:注射生理盐水照射组;0.5Gy-Ti:注射Ti颗粒悬液照射组。分别于术前(0天),术后2周,4周,8周静脉采血,行ELISA测定PINP浓度。处死前2周及4天分别注射钙黄绿素,二甲酚橙进行荧光标记。术后8周处死动物,搜集双侧股骨,行Micro-CT扫描,分析假体周围骨小梁结构;术后8周,每组3个标本进行硬组织包埋,切片,荧光纤维镜观察并测定成骨速率,SVG染色观察假体周围组织结构。Micro-CT扫描后标本进行生物力学压出试验,测定假体最大压出力。结果 Micro-CT结果显示LDI显著增加了NS注射侧的BV、BV/TV、Tb.N、BMD,同时使假体周围骨小梁SIM下降,Ti颗粒仅使假体周围DA下降,同时LDI可逆转这一效应。照射组与对照组,术后血清中的PINP含量均明显升高,术后2周达到高峰,术后8周两组均接近术前水平,但是照射组术后8周的水平仍高于术前水平,差异具有统计学意义。术后两周,照射组与对照组相比,血清PINP升高更为明显,差异具有统计学意义。硬组织切片的SVG染色可以发现,0Gy-Ti组在假体周围可见明显的Ti颗粒附着,而且在Ti颗粒周围可见明显矿化的纤维组织,同时假体周围可见纤维膜的形成。0.5Gy-NS组与0Gy-NS组相比较,未见明显的异常,但0.5Gy-Ti组与0Gy-Ti组相比,发现虽然假体周围也存在Ti颗粒并可见骨吸收,但是假体周围的炎性假膜的厚度明显变薄。荧光双标结果显示,0.5Gy-NS组与0Gy-NS组相比,两条荧光标记带的间距明显增宽,差异具有统计学意义;0Gy-Ti与0Gy-NS组相比,差异没有统计学意义。0.5Gy-Ti组与0Gy-Ti组相比,差异没有统计学意义,0.5Gy-Ti组与0.5Gy-NS组相比,新骨形成速率明显下降。对各组标本假体最大拔出力的测试结果显示,0Gy-Ti与0Gy-NS组相比,差异没有统计学意义;0.5Gy-NS组与0Gy-NS组相比,假体的最大压出力显著升高,差异具有统计学意义(p<0.05);0.5Gy-Ti组与0Gy-Ti组相比,差异没有统计学意义。结论 LDI可有效通过促进骨形成增加假体周围骨长入,提高假体的力学性能。体内的Ti颗粒将显著抵消LDI的促成骨作用但LDI可有效的抑制Ti颗粒引起的假体周围炎症反应。