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背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是一种以持续性蛋白尿为特征的临床综合症,是糖尿病微血管常见并发症之一,肾小球滤过率进行性下降,最终导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)。而DN的发病机制尚不完全清楚,目前认为,持续的高血糖状态下,血管活性物质、活性氧簇、糖基化终末产物等发生改变,引起肾脏血流动力学改变、炎症、RAAS系统的过度活化,进而导致肾小球硬化、肾间质纤维化、肾小管萎缩、系膜细胞增生、细胞外基质增加,最终导致肾脏纤维化。长链非编码RNA(Long Non-Coding RNA,Lnc RNA)是一类功能性分子,其长度大于200个核苷酸,它存在于细胞核或细胞质中,但缺乏编码蛋白质的能力,其存在于不同的细胞、组织的生物学过程中,在转录水平、转录后水平以及表观遗传学水平的基因表达中都具有调控作用,广泛参与机体的生理和病理过程。我们通过基因芯片筛选出db/db小鼠与db/m小鼠表达差异基因,生物信息学分析揭示了PVT1和SOX2OT等多种lnc RNA,在db/db小鼠的DN发生发展中发挥重要作用。目前关于SOX2OT在DN中的作用还未见报道,因此,进一步确定SOX2OT在DN中的作用,可以为明确DN的发病机制及治疗提供新的思路。目的1.观察db/db小鼠与db/m小鼠存在的表达差异基因。2.探讨与DN相关的长链非编码RNA。3.观察长链非编码RNA SOX2OT在人足细胞(human glomerular podocytes,HPCs)和人系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)中的表达情况。方法1.以db/db小鼠为DN动物模型选取自发性高血糖的雄性db/db小鼠及野生型db/m小鼠为模型,小鼠不受限制进食水,并维持20周。定期检测小鼠的体重、血糖、血肌酐、尿素氮及尿蛋白等,观察小鼠是否造模成功。至实验结束时,尾部采血方法检测快速血糖,在深度麻醉下处死小鼠,收集血标本及肾组织标本。小鼠肾组织的形态结构变化通过HE及PAS染色进行观察,肾小球基底膜区超微结构的变化通过电镜扫描进行观察。郑州大学第一附属医院临床实验室检测血肌酐、尿素氮、尿蛋白等指标。基因芯片检测表达谱改变,生物信息学及分子生物学方法明确DN状态下lnc RNA及m RNA表达变化及相互关系。2.以条件永生化的HPCs及HMCs为研究对象在体外培养HPCs及HMCs并分成三组:正常组(5.6mmol/L葡萄糖)、高糖组(40mmol/L葡萄糖)、渗透压对照组(5.6mmol/L葡萄糖+34.4mmol/L甘露醇),根据不同的分组分别培养24h后进行检测。q RT-PCR检测HPCs及HMCs中SOX2OT的m RNA表达水平。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测高糖刺激下SOX2OT在HPCs和HMCs中表达情况。结果1.观察小鼠的成模情况与db/m小鼠比较db/db小鼠体重、血糖、尿蛋白及尿素氮水平显著升高(P<0.05)。HE染色、PAS染色及电镜扫描显示db/db小鼠的足细胞足突融合,肾小球基底膜增厚,系膜基质增生。2.微阵列分析揭示db/db小鼠与db/m小鼠差异表达的基因微阵列基因芯片数据显示与db/m小鼠相比,db/db小鼠中有11673个不同表达的基因(Differently Expressed Genes,DEGs)。其中5233个基因上调,6440个基因下调。分层聚类热图,显示了样本间差异基因的分布情况。散点图及火山图显示两组比较DEGs总体分布(表达差异倍数≥2.0,P<0.05)。3.GO和KEGG pathway富集分析差异表达的m RNA通过GO分析发现DN发病中所涉及重要生物学过程的细胞组分和分子的功能。其中最富集的生物过程是谷胱甘肽生物合成过程、葡萄糖醛酸和类黄酮相关过程,如葡萄糖酸盐代谢过程、细胞葡萄糖醛酸化、类黄酮代谢过程、类黄酮葡萄糖醛酸化和类黄酮生物合成过程。乳糜微粒是最显著富集的细胞组分,分子功能主要涉及无机阴离子交换剂活性和不依赖钠的有机阴离子跨膜转运剂活性。KEGG pathway富集显示了前30个富集途径。最主要的富集途径是生物素代谢途径。但是,它只含有一个DEG(OXSM)。细胞色素P450相关途径也显著富集,包括有害物质通过细胞色素P450代谢和细胞色素P450相关的药物代谢。也可观察到一些与DN的发生和发展相关的途径,例如肾素-血管紧张素系统、PPAR信号传导途径、谷胱甘肽代谢不饱和脂肪酸的生物合成和花生四烯酸途径。4.差异表达lnc RNA和m RNA的关系及SOX2OT在DN中表达情况在所有这些DEGs中,鉴定了880个m RNA(335个上调,545个下调)和60个lnc RNA(30个上调,30个下调)。计算两组间差异表达的lnc RNA和m RNA的皮尔逊系数(Pearson Coefficients),发现它们之间存在密切的相关性(P≤0.001)。进一步通过q RT-PCR验证,发现SOX2OT显著下调。GO富集分析SOX2OT相关的m RNA也显著富集。5.SOX2OT在HPCs和HMCs中的表达情况与正常对照组相比,高糖组HPCs和HMCs中SOX2OT的表达显著降低(P<0.05),渗透压对照组未见明显改变(P>0.05)。荧光原位杂交显示在高葡萄糖刺激的HPCs和HMCs中信号持续减弱。在细胞核中有SOX2OT的存在,同时细胞质中也有表达。而在HPCs中SOX2OT主要表达于细胞质,HMCs主要表达于细胞核。结论1.db/db小鼠与db/m小鼠存在差异基因,且差异表达的lnc RNA与m RNA有密切联系,同时差异表达的SOX2OT在DN小鼠中显著下调。2.SOX2OT在不同的细胞中有着不同的表达模式,可能在DN的发生发展中发挥不同的作用。