表皮生长因子受体(EGFR)家族属于酪氨酸激酶家族,参与激活一系列复杂的细胞信号转导途径,在正常组织中调控细胞的生长、分裂、分化等重要的生理过程。EGFR家族的异常表达和活化,与肿瘤的发生、发展及恶性生物学行为关系密切。因此,靶向EGFR家族的抗肿瘤药物成为一个热点领域。EGFR家族成员EGFR(ErbB1)、ErbB 2与肿瘤的关系最为密切,研究的也最为透彻。目前已上市的或进入临床试验的针对这两个靶点的单克隆抗体药物包括西妥昔单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。但是仍有接近50%的病人对这些药物不敏感,而且在临床使用中,这些药物需要与其他单克隆抗体或者化疗药物联用,体内的安全性和有效性仍有待临床前考证。因此,研发新型的特异性抗体有着巨大的社会需求和经济效益。我们将单克隆抗体Trastuzumab的轻、重链可变区分别串联到单克隆抗体Cetuximab轻、重链的N端,由此构成了一种新型的双特异性的四价基因工程抗体(DVD-Ig)。这种分子具有免疫球蛋白结构,每条轻、重链都同时含有两个可变区,因此具有四个抗原结合位点,能够同时与Erb B1、ErbB 2两种抗原结合。在本课题的研究中,我们通过流式细胞术证实了双特异性四价抗体保留了两个抗原结合位点的结合活性,并对双特异性四价抗体和Trastuzumab、Cetuximab的体外生物学功能进行了比较分析。生长抑制实验表明,双特异性四价抗体能够抑制ErbB1阳性、Erb B2阴性或者ErbB1阴性、ErbB2阳性的肿瘤细胞系的增殖,而且这种生长抑制作用明显强于Cetuximab/Trastuzumab。我们通过Western Blot检测信号通路蛋白,结果表明,双特异性四价抗体能够抑制细胞表面Erb B1、ErbB2受体的磷酸化,以及下游信号通路蛋白MAPK、Akt的磷酸化,从而阻断肿瘤细胞信号传导,进一步的证明了双特异性四价抗体的抑瘤作用。在双特异性四价抗体抑制肿瘤细胞增殖的机理研究中,我们用流式细胞术的方法证实了四价抗体诱导细胞表面受体内吞的能力,激光共聚焦显微镜检可以直接观察到这种内吞效果。结果证实,双特异性四价抗体可以通过与ErbB1的结合,诱导同时结合的Erb B2内吞。受体内吞后,细胞表面受体密度降低,进一步阻断下游信号通路转导,达到抑制肿瘤细胞增殖效果。进一步的动物实验证明,双特异性四价抗体能够抑制小鼠肿瘤生长,这种抑制肿瘤生长的作用不仅强于Trastuzumab,Cetuximab,而且明显强于Trastuzumab、Cetuximab联合治疗。因此,我们所制备的双特异性四价抗体是一种能够有效治疗乳腺癌和结直肠癌的抗体药物,具有很大的发展潜力。