目的:(1)体外分离新生SD大鼠雪旺细胞并培养,超速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体并进行特异性蛋白鉴定。透射电镜观察雪旺细胞外泌体的粒径和分布。(2)研究雪旺细胞外泌体对神经元及雪旺细胞的生物学作用。观察和研究透明质酸凝胶缓释外泌体的生物学特征参数。(3)探讨透明质酸水凝胶包裹缓释雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管修复大鼠坐骨神经长节段缺损的形态学和功能学效果。方法:(1)采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法提取原代大鼠雪旺细胞,并采用DMEM/F12完全培养基培养和纯化。采用S100和Sox10进行纯度鉴定。采用CCK-8试剂盒对雪旺细胞的增殖状态进行检测。采用超高速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体,利用BCA试剂盒检测外泌体中蛋白的含量。Western blot法对雪旺细胞分泌外泌体表面标志物CD63、TSG101、CD9、Rab5和Na~+/K~+ATP酶进行鉴定。(2)构建1%浓度的透明质酸水凝胶,并将雪旺细胞外泌体进行包裹。体外放置于PBS中采用BCA试剂盒检测外泌体的缓释曲线。应用雪旺细胞外泌体干预雪旺细胞和神经元,CCK-8试剂盒检测外泌体对雪旺细胞的增殖作用,以及对两种细胞生物活性蛋白分泌的作用。ELISA法检测培养第1、3、5天后,外泌体干预的雪旺细胞表达神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、髓鞘零蛋白(P0)、细胞极性蛋白Par-3的水平。同时ELISA法检测外泌体干预后第1、3、5天时神经元中生长相关蛋白43(Growth-associatedprotein-43,GAP-43)、神经丝蛋白-200(Neurofilament-200,NF-200)、βIII–Tubulin的表达水平。(3)静电纺丝制备PCL神经导管,并采用扫描电镜观察导管的大体形态及显微结构,测量纤维丝的直径。采用小量程的力学仪器检测PCL神经导管的的杨氏模量、最大应力、最大载荷、最大断裂张力等力学参数。采用透明质酸水凝胶包裹雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管,制备15mm长节段大鼠坐骨神经缺损,并进行端端吻合。采用单纯透明质酸填充PCL导管作为对照组,自体神经移植组也进行对照。在术后4、8、12周时检测大鼠坐骨神经指数、再生神经电生理功能。荧光金逆行示踪检测大鼠神经元胞体的存活情况及神经再生的情况。透射电镜观察三组再生神经的有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积。NF-200和S100对各组再生神经的免疫荧光染色,观察期神经结构再生情况。HE染色观察三组大鼠腓肠肌肌纤维直径的差异。结果:(1)雪旺细胞在光镜下可以看到呈梭型,体积不大,存在双极,细胞核在中间,比较明显,有折光性。细胞多呈纵行排列的形态。雪旺细胞在接种2小时后,贴壁的比率约为23.5%,6小时时的贴壁比率增加到47.9%,而在12小时的时候有88.9%的细胞贴壁,在16小时以后细胞贴壁的比率均高于99%。在培养3天时,雪旺细胞数量较最初增长了3.9倍,而培养7天时增长了11.4倍。S-100和Sox-10双标荧光染色对雪旺细胞鉴定的纯度为97%。外泌体粒径主要分布在100-160 nm之间,本研究测得的外泌体的平均直径在125 nm。Western blot检测显示外泌体特异性蛋白CD63、TSG101、CD9在本研究所提取的雪旺细胞外泌体中均有表达,而非外泌体表达蛋白Rab5和Na~+/K~+ATP酶则未见表达。(2)外泌体在透明质酸凝胶中前3天释放比率较大,第一天释放比率为34%,第三天达到41%,随着时间的延长,释放逐渐缓慢。在第4、5、6、8、16、32天时的累积释放比率为43%、47%、51%、53%、75%、90%,而在第64天时候检测得出累积释放率为99%,几乎完全释放。对照组轴突数量为35.4±4.3,而外泌体刺激组为126.3±14.4(P<0.05)。在轴突生长长度方面,外泌体组的平均长度长达(1563.0±132.5)μm,显著高于对照组的(864.3±77.4)μm(P<0.05)。外泌体干预组雪旺细胞在培养后的第3、5、7天时细胞增殖水平均显著高于对照组(P<0.05)。外泌体刺激后的雪旺细胞分泌NGF、BDNF、髓鞘零蛋白(P0)、细胞极性蛋白Par-3的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显著升高,而第5天的表达量也均显著高于第3天的水平(P<0.05)。外泌体刺激后的DRG神经元细胞分泌的标志性蛋白进行检测,结果发现GAP-43、NF-200、βIII–Tubulin的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显著升高,而第5天的表达量也均显著高于第3天的水平(P<0.05)。(3)PCL神经导管的内孔直径为1500μm左右,而管壁的厚度约为500μm,表面纤维丝均匀分布,纤维丝平均直径为4.9μm。PCL神经导管孔隙率为(89.7±2.6)%、最大应力为(7.5±0.6)MPa、杨氏模量为(22.4±2.1)MPa、最大断裂张力为(596.4±33.8)%、最大载荷为(5.6±0.8)N,符合神经再生要求。术后第4、8、12周时PCL/HA-EXO组大鼠的再生神经有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积显著高于PCL/HA组,而G-ratio值则显著低于PCL/HA组(P<0.05)。而三个时间点中,PCL/HA-EXO的有髓轴突的数量、再生轴突的面积和G-ratio值均与自体神经移植组差异无统计学意义(P>0.05)。术后12周时可见PCL/HA-EXO组大鼠轴突沿着导管顺行生长,有明显的方向性。并且神经轴突及雪旺细胞的表达显著高于PCL/HA组,与自体神经移植组差异不明显。各组大鼠术后随着时间的延长,复合肌动作电位幅度、神经传导速度及潜伏期均有所改善,但PCL/HA-EXO组和自体神经组较PCL/HA组改善更为明显,术后4、8、12周三个时间点均显著高于PCL/HA组(P<0.05)。在术后第8周时,PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的神经传导速度及潜伏期均无显著性差异,而复合肌动作电位仍存在一些差异(P<0.05)。而术后12周时,三个指标则在PCL/HA-EXO组和自体神经移植组中无统计学差异(P>0.05)。PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数在术后三个时间点均显著高于PCL/HA组(P<0.05),并且在术后第8,12周时PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数相似,无统计学差异(P>0.05)。术后12周PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的腓肠肌纤维直径分别为(68.4±6.2)μm和(72.3±7.6)μm,显著高于PCL/HA组(P<0.05),而PCL/HA-EXO组和自体神经移植组则无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)本研究成功分离提取了新生SD大鼠雪旺细胞,纯度高,满足后续实验要求。采用超速离心法加超滤法能够成功提取雪旺细胞分泌的外泌体,经鉴定是雪旺细胞分泌的外泌体,纯度较高。(2)透明质酸水凝胶能够有效的包裹和缓释雪旺细胞分泌的外泌体,其缓释曲线与体内雪旺细胞增殖迁移及神经轴突再生的时间相似,能够更好的在体内应用。雪旺细胞分泌的外泌体能够有效的促进雪旺细胞增殖,促进雪旺细胞和神经元特异性蛋白分泌,能够较好的促进神经再生。(3)PCL/HA-EXO神经导管能够有效的促进大鼠长节段神经缺损的运动功能康复及组织学及电生理学明显改善。