论文部分内容阅读
目的利用慢病毒载体介导的shRNA-ROR1(Lv-shROR1)建立稳定沉默ROR1的肺腺癌细胞株,并利用该细胞模型初步研究ROR1调控肿瘤细胞周期、凋亡和自噬的分子机制,为后续以ROR1为治疗靶点的研究奠定基础。方法首先,使用带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的慢病毒介导shRNA-ROR1感染肺腺癌PC9、PC9erlo和NCI-H1975细胞株,利用荧光显微镜检测感染细胞中GFP的荧光信号来衡量慢病毒感染细胞的情况,并采用流式细胞术检测Lv-shROR1沉默ROR1蛋白的效率;其次,利用有限稀释法从Lv-shROR1感染的肺腺癌细胞株中挑选单细胞克隆,进一步利用免疫印迹法、流式细胞术和RT-PCR检测克隆细胞株ROR1蛋白和mRNA表达水平进而筛选出一系列稳定沉默ROR1的单细胞克隆,作为后续功能研究的细胞模型;最后,选取PC9erlo单细胞克隆R1进行后续研究,分别利用免疫印迹法检测该细胞株中沉默ROR1后细胞周期和凋亡分子水平的变化;利用Ray Bio?C-series Human Autophagy Array 1和免疫印迹法检测ROR1基因沉默前后自噬分子水平的变化;利用Human Phospho-kinase Array kit和免疫印迹法筛选ROR1基因沉默前后该细胞株中关键激酶磷酸化水平变化。预实验:利用免疫印迹法检测ROR1基因沉默前后,肺腺癌细胞中HIF-1α的表达水平。结果(1)慢病毒介导shRNA-ROR1成功地转染肺腺癌PC9、PC9erlo和NCI-H1975细胞株并沉默ROR1的表达,其ROR1抑制率分别为55%、50%和35%。(2)从转染慢病毒的PC9、PC9erlo和NCI-H1975细胞株中成功筛选出一系列稳定沉默ROR1基因的单细胞克隆,其中PC9单细胞克隆R3和R4的ROR1抑制率分别为65%和89%,PC9erlo单细胞克隆R1和R2的ROR1抑制率均为80%,NCI-H1975单细胞克隆R3和R5中ROR1的抑制率分别为42%和33%。选取PC9erlo单细胞克隆R1进行后续功能研究。(3)稳定沉默ROR1后,细胞周期的两个关键调控因子Cyclin E1和CDK4的表达水平明显下调。(4)稳定沉默ROR1后,促凋亡分子Bak、Caspase-3和Caspase-7显著上调,而抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-XL显著下调。(5)利用人自噬阵列试剂盒筛选了20个与自噬相关的分子,发现稳定沉默ROR1后,ATG7、ATG12、BNIP3L、LC3A和LC3B等自噬相关分子都有上调的趋势,免疫印迹法进一步证实LC3 A/B分子水平上调。(6)我们的研究结果进一步表明,阻断ROR1可以使Akt失活,通过去磷酸化激活GSK-3α/β,降低m TOR活性。(7)预实验中,我们发现稳定沉默ROR1后,肺腺癌PC9、PC9erlo和NCI-H1975三种细胞株中HIF-1α的表达呈下降趋势。结论我们成功构建并鉴定了一系列稳定沉默ROR1基因的肺腺癌PC9、PC9erlo和NCI-H1975单细胞克隆,为全面研究ROR1在肺腺癌细胞株中的分子机制提供了有效的细胞模型。本研究的数据表明阻断ROR1可以有效阻止肺腺癌细胞进入增殖周期、促进凋亡和自噬,而Akt/GSK-3α/β/m TOR信号通路是参与ROR1介导肿瘤发病机制的主要通路之一。ROR1可能在调节肿瘤糖酵解途径方面存在潜在机制,值得进一步研究。