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目的：心房颤动（简称房颤）是最常见的持续性心律失常。随着年龄增长房颤的发生率不断增加，75岁以上人群可达10%。心肌内向整流钾电流是心肌兴奋性和心律失常发生的中心调控者，是新的抗心律失常方法的研究目标。研究已表明房颤患者心房肌中IK1显著增加，IK1的增加，加速膜电位去极化，同时增加钠电流活性，促使动作电位时程缩短，最终导致折返加速和稳定化。盐酸苄普地尔是一种多重钙通道阻滞剂，最初主要作为具有抗心绞痛作用的抗心律失常药物应用，目前临床研究表明，长期服用盐酸苄普地尔能有效逆转慢性和难治性房颤，并维持窦性心律。基于这些观点，我们推断盐酸苄普地尔长期作用能够减少IK1，延长动作电位和促进提前终止折返，达到有效逆转房颤并维持窦性心律的治疗作用。 方法： 1.大鼠心肌细胞分离 实验室日常使用的新出生1-3天SD大鼠心脏新鲜摘除后，使用胶原酶II消化技术获得分离的心室肌细胞。将新生大鼠心肌细胞植于DMEM培养基（Sigma），并置于含5％CO2、温度37℃的孵育箱中进行培养备用。将培养的心肌细胞分为药物组和时间匹配的对照组，并分别进行膜片钳记录，分子生物学和生物化学研究分析。 2.膜片钳技术 全细胞膜片钳技术用以记录分离心室肌细胞的IK1电流（电压钳模式）。制备75mm毛细玻璃管，充满电极液为2-4MΩ，控制电位-40mV，测试电位从-120mV到+30mV,10mV间隔递增，记录IK1电流，所有的试验维持在22-24℃下进行。对于全细胞IK1电流记录。细胞外液为( mM):NaCl140, KCl5.4, MgCl21, CaCl21.8, HEPES10, Glucose10,4-AP5, chromanol293B(10μM), CdCl20.3,分别阻断Ito, IKs,和ICa,L, pH7.4。电极内液(mM):KCl140, MgCl21, EGTA10, HEPES10, Mg-ATP5, pH7.2。 3.Real-time PCR分析 使用TRIzol Reagent试剂盒提取细胞样本总RNA，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis试剂盒，合成cDNA(Roche Molecular System Inc., USA)。2μl cDNA为模板，重复会随着反转录成为样本，转录产物均分后使用。SYBR green(Roche)标记进行实时 PCR分析， KCNJ2引物, F5’-TGCCCGATTGCTGTTTTC-3’和R5’-GGCTGTCTTCG TCTATTT-3’;Caveolin-1,F5’-GGGCATCTACTTTGCCATC CT-3’和R5’-C GGCTGATGCACTGAATCTC-3’；Caveolin-3，F5’-GAAGATGTGATTG CGGAGCC-3’和 R5’-TGGAGACGGTGAAAGTGGTG-3’;GAPDH,F5’-GCCATCAACGACCCCTTCAT-3’和R5’-TTCACACCCAT CACAAACA T-3’,GAPDH作为内参，2－△△CT方法计算。 4.统计方法 所有数据均采用Mean±SEM，数据分析采用One-way ANOVA Student-Newman–Keuls or Dunnett分析，分析软件Sigma plot software ver.10(SPSS, Chicago, IL, USA). P＜0.05具有统计学意义。 结果：过去的研究已表明，盐酸苄普地尔的短期作用能够降低内向整流钾电流。因此，我们直接对盐酸苄普地尔的长期作用（24小时）在新生鼠心肌细胞中进行了评估。我们首次记录到盐酸苄普地尔的长期作用能够有效抑制新生鼠心肌细胞内向整流钾电流。Fig.1 A对照组和盐酸苄普地尔（1μM、5μM和10μM）组对内向整流钾的长期作用。表明了盐酸苄普地尔对内向整流钾电流的长期抑制作用。Fig.1 B电流-电压曲线关系揭示了盐酸苄普地尔对内向钾电流长期抑制作用，呈剂量效应关系。在-110mV时内向整流钾电流被抑制33.6%（1μM）、57.5%（5μM）和82.7%（10μM）。其次，通过实时定量PCR技术，我们发现盐酸苄普地尔的长期作用有效增加了新生大鼠心肌细胞KCNJ2-mRNA水平表达，我们研究结果显示，盐酸苄普地尔的长期作用显著增加KCNJ2-mRNA表达水平，同样呈剂量依赖关系（Fig.2A）。考虑到盐酸苄普地尔也是钙调蛋白抑制剂，加用钙调蛋白抑制剂W-7和钙调蛋白激酶抑制剂KN93，培养新生鼠心肌细胞24小时，我们发现W-7和KN93均增加新生大鼠心肌细胞KCNJ2-mRNA表达水平（Fig.2B）。正如前面所述，盐酸苄普地尔长期作用能够降低心肌细胞的内向整流钾电流，而其KCNJ2-mRNA表达是显著增加的，这种不一致，提示存在转录后修饰的可能性。最后，我们进一步研究了盐酸苄普地尔对内向整流钾电流的抑制作用和caveolins间是否存在的相作用关系，我们也同时应用CaM抑制剂W-7和CaMKII抑制剂KN93培养新生鼠心肌细胞（24小时），来进一步揭示盐酸苄普地尔降低IK1可能的潜在机制。Fig.3 A caveolin-3引物下，盐酸苄普地尔、W-7和KN93组抑制KCNJ2-mRNA表达水平，而Fig.3B caveolin-1引物下，盐酸苄普地尔、W-7和KN93组增加KCNJ2-mRNA表达水平，同样证明了caveolin-1对内向整流钾电流的负性调节作用。caveolin-3抑制KCNJ2-mRNA表达水平，抑制内向整流钾电流，与之前的研究结果一致。 结论：本研究揭示了盐酸苄普地尔的长期作用能够有效抑制心肌内向整流钾电流，进一步证明了盐酸苄普地尔主要是通过Ca2+-Ca/CaMKII信号通路对内向整流钾电流抑制作用。同时也表明了陷窝蛋白CaV-1在内向整流钾电流的负性调节作用。发现了存在KCNJ2-mRNA表达的增加和内向整流钾电流减少的不一致，我们猜测盐酸苄普地尔对内向整流钾通道的表达存在转录后修饰的可能性，这是我们接下来进一步研究的主要方向。最后，盐酸苄普地尔对内向整流钾电流的长期抑制作用是治疗房颤可能的潜在机制，也为进一步指导临床，提供了新的方向和靶点。