外伤性视神经损伤(traumatic optic neuropathy(TON))是颅脑外伤的一个严重的并发症,可部分或者完全造成视力丧失,颅脑外伤中大约有0.7-6%的患者合并视神经损伤。目前,在全世界范围内仍然没有一种公认的标准化治疗方案,也没有随机对照双盲实验来证实各种治疗方式的优缺点。视神经属于中枢神经系统的一部分,损伤以后无法再生或者再生能力极其有限,目前在临床实践中主要使用激素、改善微循环、神经营养等保守治疗和视神经减压术相结合的方法,但是治疗结果仍不满意。近年来,随着干细胞技术的蓬勃发展,干细胞应用于动物实验和人体实验并取得显著的成果,在治疗各种疾病中的优势逐渐显现。在治疗视神经方面,已经有学者将神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、牙髓间充质干细胞等细胞应用于动物实验和临床实验中,并取得了令人鼓舞的成果。人源性脂肪间充质干细胞(human Adipose-derived stem cells(hADSCs))在人体内含量丰富,获取方便、体外纯化度高、扩增能力强等多方面优点,被越来越多的基础和临床研究所关注。脂肪组织被认为是多潜能干细胞可供选择的来源,大量证据表明,在体外特定条件下,脂肪干细胞不仅能分化为内胚层细胞系,而且能分化为中胚层,外胚层细胞系,如骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞,神经细胞等。最近,脂肪干细胞被认为是最有前景的一种成体干细胞,其可以从抽吸术中安全大量的获得,可用于再生医学的研究。许多患者拥有过剩的脂肪,应用无创和无痛的方法可获得大量的脂肪,脂肪干细胞来源的神经祖细胞为神经系统疾病的细胞治疗带来了希望。大量的基础研究证实hADSCs有保护视神经和损伤修复作用并且在临床应用中显示出美好的临床应用前景,使之成为理想的移植细胞。但是干细胞属于异源性细胞,存在免疫排斥反应、致瘤性等相关问题并且我们对hADSCs的生物学特性并不是完全清楚,对于体外扩增的hADSCs是否会影响其临床使用的安全性问题还缺乏相关的研究。本实验选择视神经钳夹损伤动物模型,分别采用尾静脉和视神经损伤部位注射hADSCs,观察hADSCs对RGCs的保护作用和对GAP43、GFAP的表达影响以及对视神经轴突再生和轴突运输的作用,探讨hADSCs对全身的毒性和炎症因子的影响,为评估体外扩增的hADSCs作为临床使用的安全性问题提供重要的实验依据。一、大鼠视神经钳夹损伤动物模型的建立和评价目的:1、建立大鼠视神经钳夹损伤动物模型。2、明确大鼠视神经损伤后RGCs数量的动态变化规律。3、探讨大鼠急性视神经损伤后GAP43和GFAP在视神经和视网膜中的变化规律。方法:SD(Sprague Dawley,SD)大鼠24只,体重为220-250g按照文献方法,使用3g/100ml浓度的水合氯醛腹腔麻醉大鼠。麻醉成功后使用外科显微手术器械,在大鼠右眼上睑靠后作垂直切口,向上延伸1cm左右,眼科剪剪开穹窿部结膜,钝性分离并暴露视神经,动脉瘤夹夹持视神经,时间为5s,松开动脉瘤夹后观察大鼠瞳孔情况,如果瞳孔散大,直接对光反射消失、间接对光反射存在,且眼底镜观察眼底后,明确未损伤大鼠眼动脉、眼底供血情况良好,大鼠视神经钳夹损伤模型制作成功,纳入实验组。视神经损伤动物模型建立后,分别于伤后3天,7天,14天,28天,动物使用多聚甲醛灌注后取眼球和视神经分别行HE染色、RGCs计数、TUJ-1、GAP43和GFAP免疫荧光染色,并比较5组之间的差异。结果:1、视神经损伤后第3天,HE染色示损伤部位空泡化,少量炎性细胞侵润,视神经鞘膜完整,第14天可见大量的炎性细胞侵润和部分血管增生,第28天可见视神经萎缩变细和胶质瘢痕增生。2、视神经损伤后第3天,RGCs无明显变化,第7天、第14天、第28天明显下降,分别减少10.12%,30.5%,45.75%,61.87%。TUJ-1标记的阳性RGCs表现出相似的变化,分别下降6.62%,31.12%,46.23%,62.25%。3、正常视神经GAP43表达量极少或者不表达,损伤后在损伤部位近端GAP43开始表达,第7天达到高峰,第14天有所下降,第28天明显下降。视网膜GAP-43的表达也表现出与视神经类似的变化,第3天开始升高,第7天达到高峰,第14天开始下降,第28天明显下降。4、视神经损伤后,损伤区域GFAP免疫荧光强度明显下降,损伤近端GFAP免疫荧光强度在第3天开始增加,到第7天左右达到高峰,第28天明显下降;眼球视网膜GFAP免疫荧光强度在第3天开始增加,到第7天左右达到高峰,第28天明显下降。结论:大鼠视神经钳夹损伤动物模型稳定性良好、操作简单、可重复性高、可操作性强,可在一般无菌动物实验室内完成;该动物模型可有效模拟临床外伤性视神经损伤患者的病理生理变化规律、致伤原理以及临床相关症状。二、hADSCs对大鼠视神经钳夹损伤后RGCs的保护作用目的:探讨尾静脉和损伤部位注射hADSCs对RGCs的保护作用。方法:SD大鼠120只,重量为220g-250g,随机将其分为5组,分别为单纯损伤组,损伤部位干细胞组,损伤部位冻存液组,尾静脉干细胞组,尾静脉冻存液组,每组各24只。模型制作成功后,单纯损伤组不做任何处理,损伤部位干细胞组立即于损伤部位视神经鞘内注射hADSCs,损伤部位冻存液组立即于损伤部位视神经鞘内注射冻存液,尾静脉干细胞组立即于尾静脉注射hADSCs,尾静脉冻存液组即于尾静脉注射冻存液。治疗完成后,分别在3天、7天、14天、28天,取材行HE染色和TUJ-1免疫荧光染色,行RGCs计数,比较5组之间的差异。结果:1、伤后第3天,尾静脉干细胞组、单纯损伤组、损伤部位干细胞组之间RGCs数量差异不明显,无显著统计学意义(P>0.05);第7天和第14天,尾静脉干细胞组比单纯损伤组和损伤部位干细胞组RGCs下降速度减慢,并且有显著差异(P<0.05),单纯损伤组和损伤部位干细胞组之间无差异(P>0.05);第28天,尾静脉干细胞组、单纯损伤组、损伤部位干细胞组之间差异均不明显,无显著统计学意义(P>0.05)。2、尾静脉冻存液组、损伤部位冻存液组和单纯损伤组之间,在各个时间节点上RGCs计数均无明显差异(P>0.05)。结论:尾静脉注射hADSCs可减缓视网膜节细胞的下降速度,对RGCs具有一定的保护作用,但是这种保护作用持续时间较为短暂。三、hADSCs对大鼠视神经钳夹损伤后视神经轴突再生的影响目的:探讨hADSCs对视神经和视网膜GAP-43、GFAP表达的影响以及对轴突运输的作用。方法:选择SD大鼠120只,重量为220g-250g,随机将其分为5组,分别为单纯损伤组,损伤部位干细胞组,损伤部位冻存液组,尾静脉干细胞组,尾静脉冻存液组,每组各24只。处理方法同第二部分。治疗完成后,分别在3天、7天、14天、28天,取材行视神经、眼球免疫荧光染色(GAP43、GFAP),测定视神经、眼球组织的IOD值和GAP43阳性视神经纤维通过损伤部位的数量;另选择SD大鼠30只,处理方法相同,利用Western Blot方法在第14天测定各组视网膜GAP43蛋白含量。另选择SD大鼠30只,处理方法相同,利用罗丹明B在伤后第14天行顺行视路示踪,测定视神经纤维再生长度;结果:1、尾静脉干细胞组:视神经GAP43在损伤后第3天开始表达增加,第7天达到高峰,第14天开始下降,第28天明显下降;与单纯损伤组相比,荧光IOD值在第3天、第28天无明显统计学差异(P>0.05),在第7天、第14天有显著的统计学差异(P<0.05)。视网膜GAP43的荧光IOD值与也存在类似的改变,与单纯损伤组相比,IOD值在第3天、第28天无明显统计学差异(P>0.05),在第7天、第14天有显著的统计学差异(P<0.05)。视神经GFAP在第3天开始增加,到第7天左右达到高峰,第28天明显下降,与单纯损伤组相比,在各个时间节点上均无显著统计学差异(P>0.05);视网膜GFAP免疫荧光强度在第3天开始增加,到第14天左右达到高峰,第28天有所下降,与单纯损伤组相比第3天无显著统计学差异(P>0.05),在第7天、第14天、第28天均有显著的统计学差异(P<0.05)。2、损伤部位干细胞组:视神经GAP43在损伤后第3天开始表达增加,第7天达到高峰,第14天开始下降,第28天明显下降;与单纯损伤组相比,荧光IOD值在第3天、第28天无明显统计学差异(P>0.05),在第7天、第14天有显著的统计学差异(P<0.05)。视网膜GAP43的荧光IOD值与单纯损伤组相比,荧光IOD值在第3天、第28天无明显统计学差异(P>0.05),在第7天、第14天有显著的统计学差异(P<0.05)。视神经GFAP与单纯损伤组荧光IOD值变化一致,在各个时间节点上均无统计学差异(P>0.05);视网膜GFAP免疫荧光强度在第3天开始增加,第14天明显增加,第28天达到高峰,与单纯损伤组相比第3天无显著统计学差异(P>0.05),在第7天、第14天、第28天均存在显著的统计学差异(P<0.05)。3、损伤部位冻存液组和尾静脉冻存液组视神经GAP43和GFAP变化规律与单纯损伤组一致,在各个时间节点上均无明显差异(P>0.05);视网膜GAP43和GFAP变化规律与单纯损伤组一致,在各个时间节点上也均无明显差异(P>0.05)。4、Western Blot检测结果显示:损伤后第14天各组GAP43蛋白表达以尾静脉干细胞组和损伤部位干细胞组较高,其蛋白表达水平的相对灰度值均比单纯损伤组高,有显著统计学差异(P<0.05),其中尾静脉干细胞组蛋白表达最高,与免疫荧光测定结果相同。损伤部位干细胞组、损伤部位冻存液组和尾静脉冻存液组蛋白表达水平的相对灰度值与单纯损伤组相比均无明显差异(P>0.05)。5、GAP43阳性视神经再生纤维通过损伤部位数目:伤后第14天,尾静脉干细胞组和损伤部位干细胞组GAP43阳性视神经再生纤维通过损伤部位的纤维数目比单纯损伤组多,有显著统计学差异(P<0.05),尾静脉干细胞组比损伤部位干细胞组数量多(P<0.05)。损伤部位冻存液组和尾静脉冻存液组与单纯损伤组无明显差异(P>0.05)。6、罗丹明B顺行视路示踪:伤后第14天,尾静脉干细胞组和损伤部位干细胞组示踪剂通过损伤部位后运行的最大距离均比单纯损伤组长,存在显著统计学差异(P<0.05),尾静脉干细胞组比损伤部位干细胞组运行的最大距离更长(P<0.05)。损伤部位冻存液组和尾静脉冻存液组与单纯损伤组无明显差异(P>0.05)。结论:hADSCs对视神经损伤后的纤维再生具有促进作用,有利于视神经轴突的再生、改善轴突运输功能。四、hADSCs对视神经钳夹损伤大鼠的毒性及免疫学试验目的:明确hADSCs对大鼠全身毒性以及免疫相关因子的影响。方法:模型制作和各组处理方法均同第二部分,治疗完成后,分别在3天、7天、14天、28天处死大鼠,采用心脏取血,分别加入EDTA抗凝真空管、生化标本管和枸橼酸钠抗凝管内保存,生化标本管不采用抗凝剂,取血完成后离心、分离血清,-80℃冰箱保存备用,待标本收集完成后,统一测定,血常规和凝血功能即时送检测定。检测血常规、电解质、肝肾功能、凝血功能并采用IFN-γ、IL-4酶联免疫试剂盒检测大鼠血清IFN-γ、IL-4水平,比较各项指标五组之间的差异。结果:单纯损伤组、尾静脉干细胞组、损伤部位冻存液组、损伤部位干细胞组以及尾静脉冻存液组相比,大鼠血常规、肝肾功能、电解质、凝血功能、血清IFN-γ、IL-4水平均无明显统计学差异(P>0.05)。