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目的:慢性难愈性创面是糖尿病的最常见并发症之一,严重影响患者的生活质量,甚至危及生命。目前常规的临床治疗包括外科清创术,负压治疗以及高压氧疗等,然而其预后仍不尽人意,开发更有效的治疗方法成为临床面临的重要挑战。局部炎症微环境失衡是导致糖尿病皮肤组织再生能力差的重要原因。调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）是一类CD4+CD25+Foxp3+T细胞,具有强大的免疫抑制性功能,对于维持机体免疫系统稳态,促进组织修复与再生至关重要。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因其具有自我更新、多向分化及优秀的免疫调节能力而为难愈性糖尿病伤口的治疗带来了新的希望。间充质干细胞来源的外泌体（exosomes derived from mesenchymal stem cell,MSC-Exo）是其分泌的一种直径在30-150纳米之间的细胞外囊泡,能发挥与MSCs相似的生物学功能,因其独特的优势,在促进伤口愈合中呈现出巨大的应用前景。根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）来源于年轻恒牙根尖牙乳头,是胚胎神经嵴来源的牙源性间充质干细胞,具有优秀的免疫调节性能,尤其在调控T细胞转化及功能方面具有显著作用。根尖牙乳头干细胞来源的外泌体（exosomes derived from stem cells from apical papilla,SCAP-Exo）对糖尿病皮肤缺损的治疗效果与作用机制尚不清楚。本研究建立糖尿病皮肤缺损模型,应用SCAP-Exo缺损局部注射,观察其对于糖尿病皮肤缺损愈合的治疗作用,并通过体内外实验探索SCAP-Exo治疗的免疫调节作用机制,为将SCAP-Exo应用于治疗糖尿病皮肤缺损愈合的临床转化提供理论和实验依据。研究方法:1.应用酶消化法提取原代SCAP并对其进行鉴定,即通过倒置显微镜观察其形态,茜素红S染色观察其成骨分化能力,油红O染色观察其成脂分化能力,流式细胞术检测其表面标记物。差速离心法提取SCAP-Exo并对其进行鉴定,即通过透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）观察其形态,纳米颗粒示踪技术（nanoparticle tracking analysis,NTA）检测其粒径大小,Western blot检测外泌体特异性蛋白CD9、Alix和细胞内质网特异性蛋白Calnexin的表达情况。2.用链脲佐菌素（streptozocin,STZ）建立糖尿病小鼠模型,检测其血糖和体重,并通过H＆E染色观察胰岛的组织学改变,对糖尿病小鼠模型进行鉴定;进一步建立糖尿病小鼠皮肤缺损模型,缺损局部皮下注射PKH26标记的外泌体,免疫荧光染色对其示踪定位;缺损局部注射100μL SCAP-Exo（1μg/μL）,分别记录第3、6、9和12 d时缺损区愈合速度,H＆E染色和Masson染色观察第12 d时缺损区再上皮化程度及胶原纤维形成情况,免疫荧光染色观察缺损区及局部淋巴结Treg水平,流式细胞术检测脾脏及外周血中Treg水平;CD25中和抗体抑制糖尿病小鼠体内Treg,检测抑制Treg后对SCAP-Exo对糖尿病小鼠皮肤缺损的治疗作用的影响。3.免疫磁珠法提取小鼠脾脏CD4+T细胞,应用不同浓度的SCAP-Exo（0、10、20、40μg/mL）处理CD4+T细胞,流式细胞术及CCK-8检测其增殖的影响;流式细胞术检测Treg百分比,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测上清液中白介素10（interleukin,IL-10）的水平;Western blot检测转化生长因子受体1（transforming growth factor receptor 1,TGF-βR1）、TGF-βR2、P-SMAD2/3、SAMD2/3蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测TGF-βR1基因表达;目标区域甲基化测序(MethylTargetTM)技术检测Foxp3位点甲基化水平;qRT-PCR和Western blot检测去甲基化酶TET（ten-eleven-translocation,TET）基因和蛋白的表达水平。4.实验结果采用SPSS 23.0软件进行统计学分析,P＜0.05为差异具有统计学意义。结果:1.SCAP显微镜下观察可见细胞呈长梭状贴壁生长;SCAP成骨诱导培养4周,茜素红S染色可见矿化结节形成;SCAP成脂诱导6周,油红O染色可见细胞内脂滴形成;流式细胞术结果显示SCAP表达间充质干细胞表面标记物CD105,CD90和CD73,不表达造血干细胞表面标记物CD45,CD34和CD31。超速离心法从SCAP培养上清液中提取SCAP-Exo,TEM观察可见SCAP-Exo呈杯状囊泡样结构;NTA显示SCAP-Exo粒径峰值大小为126.3 nm;Western blot检测结果表明SCAP-Exo表达外泌体特异性标记蛋白Alix和CD9,不表达细胞内质网特异性蛋白Calnexin。2.STZ成功建立糖尿病小鼠模型,小鼠血糖值稳定高于16.7 mmol/L。H＆E染色糖尿病小鼠胰腺组织损伤严重,胰岛严重萎缩,胰岛细胞水肿变性,大量淋巴细胞浸润及红细胞渗出。免疫荧光示踪观察可见SCAP-Exo主要分布于缺损局部、外周免疫器官脾脏和淋巴结中,肝脏、肾脏、肺脏等中未见。局部应用SCAP-Exo治疗后,促进了糖尿病小鼠皮肤缺损的愈合速度,且H＆E染色和Masson染色结果显示SCAP-Exo治疗后促进了糖尿病小鼠皮肤缺损区再上皮化和胶原纤维形成。免疫荧光染色结果可见SCAP-Exo治疗后上调糖尿病小鼠皮肤缺损区及局部淋巴结Treg的表达水平,流式细胞术结果显示SCAP-Exo治疗后上调了糖尿病小鼠脾脏及外周血中Treg的表达水平。SCAP-Exo能有效恢复Treg抑制的糖尿病小鼠皮肤缺损愈合。3.Ki67和CCK-8检测结果显示SCAP-Exo对CD4+T细胞增殖无明显影响;流式细胞术结果显示SCAP-Exo能促进CD4+T细胞向Treg转化,且ELISA检测结果显示SCAP-Exo上调IL-10的表达水平;Western blot结果显示SCAP-Exo能促进TGF-βR1的表达,激活SMAD2/3信号通路;MethylTargetTM技术检测结果显示SCAP-Exo能降低CD4+T细胞Foxp3位点启动子区和CNS2区甲基化水平;Western blot及qRT-PCR结果显示SCAP-Exo能促进CD4+T细胞Tet 2的表达水平而对Tet 1和Tet 3的表达无影响。结论:SCAP-Exo能够通过上调Treg水平加速糖尿病小鼠皮肤缺损愈合速度,促进缺损区再上皮化及胶原纤维形成,其可能机制为SCAP-Exo通过上调TGF-βR1表达,激活SMAD2/3信号通路进而促进Foxp3的阳性表达,并通过Tet 2介导的Foxp3基因位点去甲基化促进Foxp3稳定表达,从而促进了Treg转化及功能稳定。