第一部分基于定量蛋白组学对褪黑素在自发性Ⅱ型糖尿病大鼠（ZDF）视网膜中作用靶点的筛选和验证目的:糖尿病性视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）是工作年龄糖尿病患者最常见的眼部并发症,由于视网膜微血管损伤,导致视力损害甚至失明。褪黑素是一种内源性神经激素,具有多种生物学特性,包括调节氧化应激、炎症、自噬和血管生成等。本课题以研究褪黑素在DR中的作用为目的,采用定量蛋白组学和生物信息学,全面分析糖尿病大鼠及褪黑素干预后的糖尿病大鼠视网膜蛋白质组及代谢通路变化,进而为后续DR生物标志物的筛选,褪黑素的作用靶点及其作用机制提供依据。方法:选用自发性Ⅱ型糖尿病大鼠Zucker Diabetic Fatty（ZDFfa/fa,ZDF）作为DR的动物模型。采用串联质谱标签Tandem Mass Tags（TMT）分别对对照鼠Zucker nondiabetic lean（ZDFfa/+,ZL）,实验鼠ZDF以及褪黑素干预的ZDF大鼠的视网膜进行标记;通过高分辨率LC-MS/MS,分别对三组视网膜进行定量蛋白组学分析,以P＜0.05且倍数差异大于等于1.5或小于等于0.67作为差异蛋白阈值筛选标准。筛选后的差异蛋白通过DAVID,PANTHER及STRING数据库进行生物信息学分析,进而获得Gene Ontology及代谢通路的分析结果。根据生物信息学分析结果筛选潜在的生物标志物,并通过Western Blot,酶联免疫吸附法,免疫组化,免疫荧光技术手段对筛选的生物标志物及差异蛋白所富集通路中的关键蛋白进行可靠性验证。结果:ZDF实验鼠与对照鼠ZL相比（ZDF/ZL）,共有43个差异蛋白。其差异蛋白主要参与到异源分解代谢、视觉感知、谷胱甘肽代谢等生物学过程;主要富集的通路有趋化因子和细胞因子介导的炎症信号通路、Wnt信号通路等。褪黑素干预后的ZDF大鼠与实验鼠ZDF相比（ZDF+M/ZDF）,共有45个差异蛋白。其差异蛋白类别有翻译蛋白、代谢物转化酶、蛋白结合活性调节等;主要富集的通路有血管生成和VEGF信号通路。共同差异蛋白8个,其中谷胱甘肽S-转移酶α 1和α4（GSTα1和GSTα4）在ZDF/ZL中明显上调,而在ZDF+M/ZDF中明显下调。验证后结果显示,GSTα 1、GSTα 4在Müller细胞上呈现荧光强阳性,在内皮细胞上也有表达,在神经元上表达相对较少。褪黑素不但降低了 ZDF大鼠视网膜中GSTα 1、GSTα4以及Wnt通路中的关键蛋白β-catenin,炎症相关因子IL-1β、TNF-α和血管生成因子VEGF的增加,还降低了 NOX2、4HNE以及凋亡相关因子的表达。结论:ZDF大鼠及褪黑素干预后的ZDF大鼠视网膜蛋白组轮廓发生显著改变,其差异蛋白参与多个生物学过程并且富集多条代谢途径,其中GSTα 1和GSTα4可初步筛选为DR的生物标志物及褪黑素的治疗靶点,且Wnt信号作为代谢通路的研究对象。推测褪黑素可能通过调节α-GSTs减轻高糖条件下视网膜的氧化应激和细胞凋亡发挥保护作用。第二部分褪黑素对高糖诱导的视网膜Müller细胞的作用及机制研究目的:上述实验发现,GSTα 1和GSTα 4可初步筛选为褪黑素治疗DR的主要靶点,且在ZDF大鼠视网膜Müller细胞上高表达。为进一步研究GSTα 1和GSTα 4在视网膜Müller细胞的表达以及褪黑素的作用机制,我们观察了褪黑素对高糖所致视网膜Müller细胞的作用及影响。方法:按以下分组:正常葡萄糖组（normalglucose,NG,5mM）、高糖组（high glucose,HG,30mM）、高糖加褪黑素（HG+M）组以及高糖加溶剂对照组（HG+V）培养视网膜Müller细胞24小时后,使用Western Blot技术检测GSTα 1、GSTα 4、NOX2、4HNE、VEGF以及凋亡相关因子Bax、Bcl-2和cleaved-caspase 3的表达水平,DCFH-DA探针检测Müller细胞中ROS变化水平,BODIPY 581/591 C11荧光探针检测Müller细胞脂质过氧化水平。结果:高糖条件下,Müller细胞中GSTα 1、GSTα4的表达显著增加,而褪黑素抑制了高糖诱导的Müller细胞中GSTα 1、GSTα 4和NOX2、4HNE、VEGF以及凋亡相关因子的高表达,同时降低了高糖条件诱导的Müller细胞中ROS的增加以及脂质过氧化水平。结论:褪黑素通过调节α-GSTs减轻高糖诱导的视网膜Müller细胞氧化应激和细胞凋亡发挥保护作用。第三部分褪黑素对高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞的作用及机制研究目的:上述实验结果提示:GSTα1和GSTα4作为褪黑素治疗DR的主要靶点,其作用机制涉及褪黑素通过调节α-GSTs减轻高糖诱导的视网膜Müller细胞氧化应激和细胞凋亡发挥保护作用。考虑到内皮细胞作为视网膜内屏障的重要组成部分且与血液接触直接受高糖及其代谢产物的刺激,而视网膜血管系统的任何结构和功能变化都与DR密切相关。因此我们接着观察了褪黑素对高糖所致的视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的影响以及HRMECs和Müller细胞共培养条件下,褪黑素的作用机制。此外,对Wnt信号进行干预观察GSTα 1、GSTα4及相关蛋白的表达以深入探讨代谢通路变化与GSTα 1、GSTα4的关系。方法:按以下分组:正常葡萄糖组（normalglucose,NG,5 mM）、高糖组（high glucose,HG,30mM）、高糖加褪黑素（HG+M）组以及高糖加溶剂对照组（HG+V）培养人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）24小时后,用Western Blot技术检测GSTα1、GSTα4、NOX2、4HNE、VEGF 和凋亡相关因子 Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3 的表达;采用DCFH-DA探针检测HRMECs中ROS变化水平,BODIPY581/591 C11荧光探针检测细胞脂质过氧化水平,Edu检测细胞增殖,划痕实验和Transwell检测细胞迁移和侵袭以及管腔形成实验检测细胞的成管能力。此外,将高糖条件下的HRMECs与不同干预条件的下Müller细胞共培养,以Western Blot检测HRMECs中GSTα 1、GSTα4、VEGF和屏障相关因子ZO-1的表达,Edu检测HRMECs的增殖,管腔形成实验检测细胞的成管能力以及Tranwell检测Müller细胞的迁移。进一步以氯化锂和Dickkopf-1激活和抑制Wnt信号,检测GSTα 1、GSTα 4、VEGF、ZO-1以及凋亡相关因子Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3的表达。结果:高糖条件下,HRMECs中GSTα 1、GSTα4及ZO-1的表达降低,NOX2、4HNE、VEGF表达升高,而褪黑素增加了GSTα 1、GSTα4及ZO-1的表达,降低了NOX2、4HNE、VEGF水平。此外,褪黑素不但降低了高糖诱导HRMECs中ROS的增加及脂质过氧化水平,同时抑制了细胞增殖、迁移、侵袭以及管腔的形成。HRMECs与Müller细胞共培养条件下,褪黑素抑制了 HRMECs的增殖和管腔形成以及Müller细胞迁移。褪黑素或与正常葡萄糖下的Müller细胞共培养可增加高糖条件下HRMECs中GSTα1、GSTα4及ZO-1的表达,降低VEGF的升高。此外,激活Wnt通路,阻断了褪黑素和Dickkopf-1增加GSTα 1、GSTα 4、ZO-1以及降低VEGF和炎症相关因子的表达。结论:在高糖条件下,褪黑素通过抑制Wnt/β-catenin信号通路调节内皮细胞中α-GSTs介导的氧化应激及细胞凋亡。并且视网膜Müller细胞对高糖诱导的视网膜内皮细胞氧化应激损伤具有保护作用。