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研究目的：
有多种因素可导致生殖健康问题，而男性性腺（睾丸）的功能状态是影响男性生殖健康的主要因素，并且能影响后代的生理健康状态，从而使儿童出现多种疾病。睾丸间质细胞（Leydigcell，LC）主要存在于雄性哺乳动物睾丸生精小管周围的间质中，可以产生雄激素来维持男性的生殖功能。其中睾酮是雄激素的一种，在刺激精子发生、维持第二性征、促进肌肉松弛和骨骼健康方面发挥着关键作用。有研究显示，单次腹膜内注射乙烷二甲磺酸盐（Ethanedimethanesulfonate，EDS）后，可以在成年大鼠的睾丸中实现睾丸间质细胞的再生。目前已经发现大鼠睾丸中存在所有21种成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfactor，FGF），其中FGF16的表达在这些因子中最高。FGF16是旁分泌因子，属于FGF9的亚家族，是分泌或锚定的蛋白质，在细胞发育过程中发挥关键作用，包括细胞的增殖和分化，并发挥调节形态、内分泌和旁分泌的作用。本研究的目的是研究FGF16对EDS处理后的大鼠睾丸间质干细胞再生的影响。
研究方法：
FGF16体外实验：取成年（60日龄）雄性SD大鼠，经一次腹腔注射乙烷二甲烷磺酸（EDS，75mg/kg）以彻底消除睾丸间质细胞（LC）。处死大鼠后取睾丸，分离曲细精管，将曲细精管用睾丸间质干细胞（SLC）分化诱导剂（LDM培养基，含LH+Li）处理，并用0、1、10和100ng/mL的FGF16处理3周，收集培养基，用化学发光法检测睾酮；收集部分曲细精管提取RNA进行QPCR，测量LC的表达基因Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1、Insl3和Nr5a1的水平；收集部分曲细精管提取蛋白进行Westernblot（WB），测量表达LC的蛋白LHCGR、CYP11A1、CYP17A1、INSL3和NR5A1的水平。另外取曲细精管用0、10和100ng/mL的FGF16处理5天后，进行EdU掺入，测量SLC的增殖情况。
FGF16体内实验：使用24只60日龄雄性SD大鼠并使其适应新的动物房环境一周后。给每只大鼠腹膜内注射EDS（75mg/kg）以消除成年大鼠睾丸中的睾丸间质细胞。随机分为3组：0（生理盐水组）、10ng/睾丸FGF16组和100ng/睾丸FGF16组，每组8只。从EDS后第14天开始，每天每只睾丸内注射生理盐水或FGF16（50uL），共14天。EDS后第28天处死大鼠，取血清，采用化学发光法测量血清睾酮，ELISA法测量血清促黄体激素（Luteinizinghormone，LH）和促卵泡激素（Folliclestimulatinghormone，FSH）水平。取睾丸称重，一只睾丸冰冻，一半组织提取RNA，采用QPCR法测量睾丸间质干细胞相关基因（Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Hsd11b1和Nr5a1）和睾丸支持细胞相关基因（Fshr、Dhh和Sox9）的表达；另一半组织提取蛋白，采用WB法测量蛋白LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、3β-HSD1、CYP17A1、NR5A1、DHH、FSHR、SOX9、AKT1、p-AKT1、AKT2、p-AKT2、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平；另一只睾丸用Bouin’s液固定，制作石蜡切片，免疫组织化学染色后期LC生物标记11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）和所有LC生物标记胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1），测量LC的数量、大小、胞核大小、胞浆大小和它们的蛋白密度；部分切片进行免疫荧光共染色LC生物标记CYP11A1和增殖标记蛋白PCNA，以观察LC细胞的增殖情况。
研究结果：
FGF16体外实验：取成年（60日龄）雄性SD大鼠，经一次腹腔注射乙烷二甲烷磺酸（EDS，75mg/kg）以彻底消除睾丸间质细胞（LC）。处死大鼠后取睾丸，分离曲细精管，将曲细精管用睾丸间质干细胞（SLC）分化诱导剂（LDM培养基，含LH+Li）处理，并用0、1、10和100ng/mL的FGF16处理3周，收集培养基，用化学发光法检测睾酮；收集部分曲细精管提取RNA进行QPCR，测量LC的表达基因Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1、Insl3和Nr5a1的水平；收集部分曲细精管提取蛋白进行Westernblot（WB），测量表达LC的蛋白LHCGR、CYP11A1、CYP17A1、INSL3和NR5A1的水平。另外取曲细精管用0、10和100ng/mL的FGF16处理5天后，进行EdU掺入，测量SLC的增殖情况。
FGF16体内实验：使用24只60日龄雄性SD大鼠并使其适应新的动物房环境一周后。给每只大鼠腹膜内注射EDS（75mg/kg）以消除成年大鼠睾丸中的睾丸间质细胞。随机分为3组：0（生理盐水组）、10ng/睾丸FGF16组和100ng/睾丸FGF16组，每组8只。从EDS后第14天开始，每天每只睾丸内注射生理盐水或FGF16（50uL），共14天。EDS后第28天处死大鼠，取血清，采用化学发光法测量血清睾酮，ELISA法测量LH和FSH水平。取睾丸称重，一只睾丸冰冻，一半组织提取RNA，采用QPCR法测量睾丸间质干细胞相关基因（Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Hsd11b1和Nr5a1）和睾丸支持细胞相关基因（Fshr、Dhh和Sox9）的表达；另一半组织提取蛋白，采用WB法测量蛋白LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、3β-HSD1、CYP17A1、NR5A1、DHH、FSHR、SOX9、AKT1、p-AKT1、AKT2、p-AKT2、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平；另一只睾丸用Bouin’s液固定，制作石蜡切片，免疫组织化学染色后期LC生物标记11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）和所有LC生物标记胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1），测量LC的数量、大小、胞核大小、胞浆大小和它们的蛋白密度；部分切片进行免疫荧光共染色LC生物标记CYP11A1和增殖标记蛋白PCNA，以观察LC细胞的增殖情况。
结论：
本研究表明，FGF16刺激祖细胞和睾丸间质干细胞增殖，但抑制其分化，从而降低睾酮的生物合成，这些可能通过调节AKT和ERK/MAPK信号传导途径来进行调控。
有多种因素可导致生殖健康问题，而男性性腺（睾丸）的功能状态是影响男性生殖健康的主要因素，并且能影响后代的生理健康状态，从而使儿童出现多种疾病。睾丸间质细胞（Leydigcell，LC）主要存在于雄性哺乳动物睾丸生精小管周围的间质中，可以产生雄激素来维持男性的生殖功能。其中睾酮是雄激素的一种，在刺激精子发生、维持第二性征、促进肌肉松弛和骨骼健康方面发挥着关键作用。有研究显示，单次腹膜内注射乙烷二甲磺酸盐（Ethanedimethanesulfonate，EDS）后，可以在成年大鼠的睾丸中实现睾丸间质细胞的再生。目前已经发现大鼠睾丸中存在所有21种成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfactor，FGF），其中FGF16的表达在这些因子中最高。FGF16是旁分泌因子，属于FGF9的亚家族，是分泌或锚定的蛋白质，在细胞发育过程中发挥关键作用，包括细胞的增殖和分化，并发挥调节形态、内分泌和旁分泌的作用。本研究的目的是研究FGF16对EDS处理后的大鼠睾丸间质干细胞再生的影响。
研究方法：
FGF16体外实验：取成年（60日龄）雄性SD大鼠，经一次腹腔注射乙烷二甲烷磺酸（EDS，75mg/kg）以彻底消除睾丸间质细胞（LC）。处死大鼠后取睾丸，分离曲细精管，将曲细精管用睾丸间质干细胞（SLC）分化诱导剂（LDM培养基，含LH+Li）处理，并用0、1、10和100ng/mL的FGF16处理3周，收集培养基，用化学发光法检测睾酮；收集部分曲细精管提取RNA进行QPCR，测量LC的表达基因Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1、Insl3和Nr5a1的水平；收集部分曲细精管提取蛋白进行Westernblot（WB），测量表达LC的蛋白LHCGR、CYP11A1、CYP17A1、INSL3和NR5A1的水平。另外取曲细精管用0、10和100ng/mL的FGF16处理5天后，进行EdU掺入，测量SLC的增殖情况。
FGF16体内实验：使用24只60日龄雄性SD大鼠并使其适应新的动物房环境一周后。给每只大鼠腹膜内注射EDS（75mg/kg）以消除成年大鼠睾丸中的睾丸间质细胞。随机分为3组：0（生理盐水组）、10ng/睾丸FGF16组和100ng/睾丸FGF16组，每组8只。从EDS后第14天开始，每天每只睾丸内注射生理盐水或FGF16（50uL），共14天。EDS后第28天处死大鼠，取血清，采用化学发光法测量血清睾酮，ELISA法测量血清促黄体激素（Luteinizinghormone，LH）和促卵泡激素（Folliclestimulatinghormone，FSH）水平。取睾丸称重，一只睾丸冰冻，一半组织提取RNA，采用QPCR法测量睾丸间质干细胞相关基因（Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Hsd11b1和Nr5a1）和睾丸支持细胞相关基因（Fshr、Dhh和Sox9）的表达；另一半组织提取蛋白，采用WB法测量蛋白LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、3β-HSD1、CYP17A1、NR5A1、DHH、FSHR、SOX9、AKT1、p-AKT1、AKT2、p-AKT2、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平；另一只睾丸用Bouin’s液固定，制作石蜡切片，免疫组织化学染色后期LC生物标记11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）和所有LC生物标记胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1），测量LC的数量、大小、胞核大小、胞浆大小和它们的蛋白密度；部分切片进行免疫荧光共染色LC生物标记CYP11A1和增殖标记蛋白PCNA，以观察LC细胞的增殖情况。
研究结果：
FGF16体外实验：取成年（60日龄）雄性SD大鼠，经一次腹腔注射乙烷二甲烷磺酸（EDS，75mg/kg）以彻底消除睾丸间质细胞（LC）。处死大鼠后取睾丸，分离曲细精管，将曲细精管用睾丸间质干细胞（SLC）分化诱导剂（LDM培养基，含LH+Li）处理，并用0、1、10和100ng/mL的FGF16处理3周，收集培养基，用化学发光法检测睾酮；收集部分曲细精管提取RNA进行QPCR，测量LC的表达基因Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1、Insl3和Nr5a1的水平；收集部分曲细精管提取蛋白进行Westernblot（WB），测量表达LC的蛋白LHCGR、CYP11A1、CYP17A1、INSL3和NR5A1的水平。另外取曲细精管用0、10和100ng/mL的FGF16处理5天后，进行EdU掺入，测量SLC的增殖情况。
FGF16体内实验：使用24只60日龄雄性SD大鼠并使其适应新的动物房环境一周后。给每只大鼠腹膜内注射EDS（75mg/kg）以消除成年大鼠睾丸中的睾丸间质细胞。随机分为3组：0（生理盐水组）、10ng/睾丸FGF16组和100ng/睾丸FGF16组，每组8只。从EDS后第14天开始，每天每只睾丸内注射生理盐水或FGF16（50uL），共14天。EDS后第28天处死大鼠，取血清，采用化学发光法测量血清睾酮，ELISA法测量LH和FSH水平。取睾丸称重，一只睾丸冰冻，一半组织提取RNA，采用QPCR法测量睾丸间质干细胞相关基因（Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Hsd11b1和Nr5a1）和睾丸支持细胞相关基因（Fshr、Dhh和Sox9）的表达；另一半组织提取蛋白，采用WB法测量蛋白LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、3β-HSD1、CYP17A1、NR5A1、DHH、FSHR、SOX9、AKT1、p-AKT1、AKT2、p-AKT2、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平；另一只睾丸用Bouin’s液固定，制作石蜡切片，免疫组织化学染色后期LC生物标记11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）和所有LC生物标记胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1），测量LC的数量、大小、胞核大小、胞浆大小和它们的蛋白密度；部分切片进行免疫荧光共染色LC生物标记CYP11A1和增殖标记蛋白PCNA，以观察LC细胞的增殖情况。
结论：
本研究表明，FGF16刺激祖细胞和睾丸间质干细胞增殖，但抑制其分化，从而降低睾酮的生物合成，这些可能通过调节AKT和ERK/MAPK信号传导途径来进行调控。