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背景和目的:唾液腺腺样囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是来源于唾液腺上皮的恶性肿瘤,约占唾液腺恶性肿瘤的30%;SACC具有临床进展缓慢、嗜神经和血管侵袭性、术后极易局部复发和发生肺、骨、肝等远处转移、预后差等生物学特性。往往患者因侵犯神经而引起疼痛和神经麻痹成为其就诊的主要原因。尽管近年来在手术和其他治疗方法上取得了一定进展,但是SACC肿瘤患者的10年总存活率与复发率无明显改善,术后复发及远处转移仍是导致患者死亡的主要原因。Sox4(sex-determining region Y-related HMG box)是 Sox 转录因子家族的重要成员,是Sox家族中第一个被发现的转录因子。Sox4基因位于人类Y染色体6p22.3,编码蛋白质的相对分子质量约47KD;Sox4蛋白在结构上有2个重要的功能区分别是:能够和DNA特异序列AACAAAG结合HMG结构域,和位于C端的TAD转录激活结构域。近年来,越来越多的研究发现,Sox4在人类许多肿瘤中表达升高并且与肿瘤的发展密切相关。本研究首先通过分析和组织研究发现Sox4在人唾液腺腺样囊性癌组织和细胞中高表达,其次进一步通过分子生物学实验发现,Sox4可以调节人唾液腺腺样囊性癌细胞SACC-M和SACC-83增殖、侵袭、迁移和凋亡功能。最后,我们通过CHIP研究发现,Sox4能直接结合到Wnt7a启动子区,从而调控Wnt7a-Akt/mTOR信号通路。因此,本研究发现Sox4在人唾液腺腺样囊性癌组织和细胞中高表达,可能通过调控Wnt7a-Akt/mTOR信号通路从而影响SACC-M和SACC-83细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡功能。研究方法:一、Sox4在人唾液腺腺样囊性癌中的表达①Sox4在人唾液腺腺样囊性癌中的表达检测:通过Oncomine数据库检测Sox4在人唾液腺腺样囊性癌的表达情况。②Sox4在5对人唾液腺腺样囊性癌组织样本中的表达检测:利用Western-blot技术,在5对例临床腺样囊性癌组织样本中检测Sox4的表达情况。二、Sox4对人唾液腺腺样囊性癌细胞的增殖能力的影响Sox4对SACC-83和SACC-M细胞增殖能力影响的检测:在SACC-83和SACC-M细胞中应用siRNAl或者siRNA2质粒转染及阴性对照转染后,通过qRT-PCR和Western-blot技术验证Sox4表达情况,进一步通过CCK8和克隆形成实验检测下调Sox4后SACC细胞的增殖情况。三、Sox4对人唾液腺腺样囊性癌细胞侵袭迁移能力及凋亡的影响Sox4对SACC-83和SACC-M细胞侵袭、迁移和凋亡的影响:在SACC-83和SACC-M细胞中行siRNA1或者siRNA2质粒转染及阴性对照转染后,进一步通过Transwell,划痕实验,流式凋亡实验检测Sox4表达水平的变化对人唾液腺腺样囊细胞侵袭迁移能力及凋亡的影响。四、Sox4调控人唾液腺腺样囊性癌细胞功能的分子机制①我们通过生物信息学预测发现Sox4的靶基因Wnt7a结合位点。②构建Sox4过表达质粒、靶基因野生报告质粒和靶基因突变报告质粒,利用双荧光素酶报告基因实验共转Sox4和靶基因野生报告质粒、靶基因突变报告质粒,检测Sox4对Sox4野生报告质粒的表达活性的影响。③通过CHIP实验验证,Sox4能结合到靶基因Wnt7a的启动子区。④Western-blot进一步检测下调Sox4对Wnt7a下游的Akt/mTOR通路的活化的影响。研究结果:一、Sox4在人唾液腺腺样囊性癌中高表达①通过Oncomine数据库检测发现Sox4在人唾液腺样囊性癌中高表达。②利用Western-blot技术发现,在5例临床人唾液腺腺样囊性癌组织样本中与正常瘤旁组织比较Sox4高表达二、下调Sox4对人唾液腺腺样囊性癌细胞的增殖有抑制作用在体外细胞学实验中,在SACC-83和SACC-M细胞中行siRNA1或者siRNA2质粒转染及阴性对照转染沉默Sox4,结果显示下调Sox4可以显著抑制人腺样囊性癌细胞的增殖。三、下调Sox4抑制人唾液腺腺样囊性癌细胞的侵袭迁移能力,诱导凋亡作用在体外细胞学实验中,在SACC-83和SACC-M细胞中下调Sox4,Transwell,划痕实验显示,下调Sox4可抑制人唾液腺腺样囊性癌细胞的侵袭和迁移能力,同时流式凋亡实验显示下调Sox4可诱导人唾液腺腺样囊性癌细胞凋亡。四、下调Sox4可以抑制Wnt7a-Akt/mTOR通路的激活①我们通过生物信息学预测发现Sox4在其靶基因Wnt7a启动子区的结合位点位于-1387 bp到-1371 bp。②构建Sox4过表达质粒、Wnt7a野生报告质粒和Wnt7a突变报告质粒,利用双荧光素酶报告基因实验共转Sox4和Wnt7a野生报告质粒、Wnt7a突变报告质粒,发现Sox4能促进Sox4野生报告质粒的表达活性,而Wnt7a的突变质粒无明显作用。③通过CHIP实验进一步验证,Sox4能结合到Wnt7a启动子区。④Western-blot进一步发现表明下调Sox4可以抑制Wnt7a-Akt/mTOR通路的活化。结论:①Sox4在人唾液腺腺样囊性癌中高表达。②体外实验表明:下调Sox4可抑制人唾液腺腺样囊性癌细胞的增殖,侵袭,迁移能力,诱导细胞的凋亡作用。③下调Sox4可抑制Wnt7a-Akt/mTOR通路的活化,从而表明Sox4可能是通过影响Wnt7a-Akt/mTOR通路参与人唾液腺腺样囊性癌细胞功能的调控,为人唾液腺腺样囊性癌的诊疗提供了一个新靶点。