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研究背景与目的:胃癌的强异质性导致目前可应用于临床诊治的分子靶点甚少,寻找新型有效的靶点可望进一步提高胃癌疗效。蛋白磷酸化修饰是肿瘤病理进程中的重要事件,而蛋白激酶是蛋白磷酸化发生的必要组成部分。Fyn是属于SRC家族的非受体酪氨酸蛋白激酶,其广泛参与多种肿瘤的发生发展,然而在胃癌中的致病机制未知。TOPK是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,已有研究表明TOPK在多种肿瘤中蛋白表达水平及活性升高,进而促进肿瘤的发生发展,其中包括胃癌。SRC作为TOPK上游分子磷酸化TOPK导致结肠癌的发生已经得到相关研究证实。结合我们前期研究发现Fyn和TOPK在胃癌组织及细胞中均高表达,而Fyn和SRC同属一个蛋白激酶家族,因此我们推测Fyn是否可直接结合并激活TOPK。为了证实我们的推测,接下来我们探究Fyn与TOPK在胃癌临床样本中表达的相关性以及Fyn是否磷酸化TOPK和磷酸化位点,明确Fyn在胃癌发生发展中的角色及其中潜在的机制。研究对象和方法:1、检测Fyn和TOPK蛋白在多种胃癌细胞株和正常胃粘膜上皮细胞中表达水平差异。2、在下调Fyn表达后,采用MTT实验和软琼脂克隆形成实验(soft agar)检测沉默Fyn对胃癌细胞增殖的影响。3、通过磷32标记的同位素实验验证Fyn是否直接磷酸化TOPK。在确认Fyn磷酸胡TOPK后,利用NetPhos3.1软件预测TOPK最有可能被Fyn磷酸化的酪氨酸位点。根据预测的酪氨酸位点合成相应肽段,同位素实验确认Fyn磷酸化TOPK位点。合成上一步确认的磷酸化位点的磷酸化抗体(p-TOPK(Y74)、p-TOPK(Y272),然后构建TOPKY74、Y272单突变和Y74Y272双突变原核表达质粒,并表达蛋白,通过体外激酶实验验证Fyn主要在Y272磷酸化TOPK。4、通过蛋白质体外结合实验(pull-down)和免疫共沉淀(CO-IP)实验在细胞水平证实Fyn可直接结合TOPK。5、通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测沉默Fyn表达后对TOPK磷酸化水平的影响及TOPK下游信号通路分子的变化。6、利用免疫组化实验检测Fyn、非磷酸化和磷酸化TOPK蛋白在胃癌患者组织中的表达水平。制备TOPK(P-Y272)抗体;胃癌临床标本96例。7、分析Fyn和TOPK在胃癌和癌旁组织的间的表达差异,并利用癌症数据库分析Fyn和TOPK与患者总体生存期(OS)之间的关系。研究结果:1、Fyn在胃癌组织和胃癌细胞中高表达且是导致胃癌患者预后不良的分子靶标。2、Fyn与TOPK表达水平成正相关及导致胃癌患者预后差。3、沉默Fyn表达可抑制胃癌细胞的增殖及克隆形成能力。4、体内外实验证实Fyn可与TOPK直接结合。5、体外激酶实验证实Fyn可在Y272位点磷酸化TOPK。6、Fyn磷酸化TOPK通过激活下游ERK信号通路促进胃癌的增殖。结论:1、Fyn蛋白过表达预示胃癌患者预后差相关。2、Fyn在Y272位点磷酸化TOPK。3、Fyn与TOPK在胃癌组织的表达成强正相关。