论文部分内容阅读
一、研究背景肥胖是由机体能量摄入超过能量消耗而造成的一类代谢综合征,具有白色脂肪组织(WAT)过度沉积、中性脂肪细胞异常增殖及分化失衡的主要表现。同时由于脂肪组织具备调节体温、储存能量、缓冲机械冲击等作用,而肥胖加剧了脂肪组织的炎症效应,致使一些心血管疾病如高血压、血栓等的发病率同死亡率都增高。细胞生物学方面,前脂肪细胞是一类同时具有增殖及分化为成熟脂肪细胞能力的前体细胞,此种前体细胞在不同的生长因子、激素等的作用下,经历有丝分裂克隆期、生长停滞期、进一步的克隆期、终末分化四个阶段,细胞本身的成纤维状态发生改变,通过胞质内甘油三酯聚集形成成熟脂肪细胞,这一过程,称为“成脂分化”,该过程一直是肥胖研究领域的热点。为了能够直观地了解细胞分化内部脂质累积的过程,需要在体外建立数量可控,分化较为稳定的成熟脂肪细胞分化模型。小鼠的3T3L1细胞源于18天左右胎龄的Swiss小鼠胚胎,能够在适当的诱导条件下分化为成熟脂肪细胞,同时将其移植入小鼠的体内后也可以进行单一分化,能模拟活体脂肪组织,因此3T3-L1成纤维细胞系一直是最广泛用来进行相关体外研究的细胞系之一[1,2]。经典的3T3-L1前脂肪细胞诱导法是通过将固定剂量的地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、胰岛素和细胞基础培养液相混合,再用不同的诱导培养液按照一定时间差异培养细胞,称为“鸡尾酒”法[3]。但是该方法在使用的过程中发现存在受培养器材和细胞代数影响、转化率较低、分化过程不稳定等缺点[4],因此关于此种细胞诱导分化法的不同操作方法和培养体系的研究层出不穷。但总体来说,皆是使用此三种诱导因子,但诱导剂浓度的不同、作用时间的长短、培养液内容物的浓度不同,都会使得细胞分化的效率受到影响。因此首先对3T3L1细胞诱导分化条件进行探索和优化,建立适合的细胞模型对进行后续的研究至关重要。所以以经典文献报道为基础,结合实验室的实际工作条件开展了一系列关于该细胞系成脂分化条件的摸索,建立了具备较高分化率的方法。Micro RNA作为近二十年生物学研究的焦点之一,这类调控性非编码RNA在脂肪细胞分化、增殖存活中的作用被广泛揭示,提示其可能作为一种新型的生物靶标对肥胖相关疾病的诊疗发挥作用[5]。因此以3T3L1细胞为模型,将选取的miR-222-3p尝试转染进细胞,初步确定了转染条件,同时应用较为权威的一系列的miRNA靶标预测软件,对miR-222-3p影响细胞脂肪分化过程的机制进行了预测,以期对后续的研究提供基础参考。二、目的本课题首先对小鼠3T3L1成纤维细胞进行规范化的体外培养,再以经典“鸡尾酒”诱导法为模型方法,通过改变诱导剂的作用时间以及培养液葡萄糖浓度来探究出一套合适本实验室的高效诱导分化方法。同时对特定的miR-222-3p转染进细胞的条件以及可能作用的靶标进行了预测,对下一步机制的探讨提供了参考。三、方法1.对购买的3T3L1前脂肪进行了细胞复苏、培养、冻存等基础的细胞处理操作。2.经典“鸡尾酒”激素法诱导前脂肪细胞分化,油红O染色,显微镜下观察诱导分化率。3.通过改变诱导液中基础DMEM培养基的葡萄糖浓度,来探究葡萄糖浓度对3T3L1前细胞成脂分化率的影响。4.通过改变诱导液在诱导过程中的作用时间来探究诱导剂作用时间对3T3L1前细胞成脂分化率的影响。5.脂质体转染miR-222-3p mimic、inhibitor及相应对照物进3T3L1前脂肪细胞,使用RT-q PCR对转染进行鉴定。6.使用miRand、miRDB.pic Tar、Target Scan7等预测软件对miR-222-3p对脂肪细胞基本生理过程如分化的影响的可能作用靶基因进行预测。四、结果1.经典“鸡尾酒”方法处理诱导3T3L1前脂肪细胞,诱导完成后经油红O染色,镜下观察到甘油三酯脂肪滴生成。2.分别使用高糖DMEM培养基(葡萄糖含量4500mg/L)、低糖DMEM培养基(葡萄糖含量1000mg/L)、RPMI-1640培养基(葡萄糖含量2000mg/L)作为诱导基础培养基对细胞进行诱导,诱导过程结束后,染色结果显示,低糖诱导组的阳性细胞率显著高于其于两组(*P<0.05),而高糖组和1640组诱导率水平相似,皆高于对照组。3.在经典“鸡尾酒”诱导法的基础上,通过改变诱液Ⅱ的作用时间,诱导结束后,油红O染色结果显示,(day 3)组阳性细胞数显著高于(day2)组和(day4)组(*P<0.05),而(day2)组和(day 4)组则无明显差异,各实验组分化诱导率显著高于对照组。4.将miR-222-3p mimic、inhibitor及相应对照物用脂质体转染试剂转染入3T3L1前脂肪细胞,使用特异性总miRNA抽提试剂盒,进行RT-q PCR实验来进行转染效果的检测,结果发现miR-222-3p含量mimic组显著高于对照组,inhibitor组则低于对照组。(*P<0.05)5.分别使用四种miRNA靶标在线预测工具对miR-222-3p可能存在的靶标进行预测,将各组结果使用Venny2.1.0在线取交集后,得出12个潜在的靶标。五、结论1.经典“鸡尾酒”法诱导3T3L1前脂肪细胞进行诱导分化,分化完成的细胞出现脂滴聚集,但是比率不高,对照组为胞浆中未有脂滴形成的未分化细胞。2.改变诱导液中基础培养基的葡萄糖浓度发现,低糖组具有更高的诱导分化效应。3.改变诱导液Ⅱ的作用时间,结果显示,使用诱导液Ⅱ处理细胞3天后,相比传统的“鸡尾酒”方法处理2天,细胞诱导分化率更高,再延长时间则分化率不再提高。4.不同的靶标预测软件,预测到了多个相同的miR-222-3p作用靶标,分析发现miR-222-3p可能通过作用于insig 1参与脂肪细胞的调控。