大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一,每年导致全球十几亿美元的直接经济损失。研究大豆疫霉侵染大豆过程中效应分子的作用机制对于进一步揭示在与寄主互作过程中的病原菌的侵染机制非常重要。大豆疫霉基因组中有将近400个RxLR效应分子,研究发现效应分子的RxLR motif可以与植物细胞膜上的P13P结合,帮助效应分子进入寄主细胞内。目前的研究已经发现一些效应分子能够在植物细胞内发挥毒性功能,抑制植物的免疫反应,帮助病原菌的侵染。本实验室之前对大豆疫霉RxLR效应分子的功能进行大规模的筛选,发现大多效应分子都能够抑制植物的细胞死亡,也有部分效应分子可以直接诱导植物免疫反应。在侵染初期显著上调表达的效应分子主要作用是抑制植物对病原菌识别产生的PTI(PAMP-triggered immunity),组成型高表达的效应分子则与抑制ETI (Effector-triggered immunity)有关,效应分子转录的精确编程对于大豆疫霉的致病性非常重要,效应分子之间相互协作以“团队作战”的方式干扰植物的抗病反应,促进病原菌的侵染。本研究综合之前对于大豆疫霉效应分子功能的大规模筛选结果,挑选出了15个RxLR效应分子进行进一步分析。首先通过Solexa数据库对这些效应分子转录水平进行分析,发现有几个效应分子通过Solexa检测不到表达,其余的都在侵染初期有不同程度的上调表达,说明这些效应分子在侵染初期对病原菌侵染和定殖可能有重要的作用。在植物细胞中瞬时表达这些效应蛋白与GFP的融合蛋白,进行亚细胞定位实验发现,效应分子Avh18、Avh94、Avh97、Avh172、Avh244、Avh247、Avh256和Avh260定位在植物细胞质和细胞质核中；效应分子Avh23、Avh52和Avh240定位在植物的细胞核中；另外,效应分子Avh181和Avh241定位在植物的细胞膜上。大豆疫霉的不同效应分子在植物中的亚细胞定位具有多样性,这种定位的多样性决定了效应分子在植物细胞中作用的多样性。其中,能够在烟草上引起强烈坏死反应的效应分子Avh241在烟草细胞、洋葱表皮细胞以及拟南芥原生质体中都定位于细胞膜上。同时,通过在大豆、番茄、拟南芥上瞬时表达Avh241都能够诱导细胞死亡。生物信息学分析比对发现Avh241蛋白与已知蛋白序列无明显同源性。通过对十几种不同大豆疫霉小种中的Avh241基因进行克隆测序比对发现,其在种内很保守,没有序列多态性。同时,我们对Avh241的不同突变体进行功能分析,发现Avh241的59到168位氨基酸对于引起细胞死亡的功能是必须的。Avh241蛋白的N端6个氨基酸GAAKAK决定了蛋白的膜定位,且膜定位与引起细胞死亡的功能密切相关。Avh241能够引起多种植物的细胞死亡,所以这种细胞死亡是广谱性的。通过在不含抗病基因和含有不同抗病基因的大豆品种上瞬时表达Avh241,发现均能够引起细胞死亡,说明这种细胞死亡是不依赖于目前已发现的大豆抗病基因的。Avh241能够引发拟南芥的突变体rpml,sgt1b和rarl的原生质体细胞死亡,说明被识别的途径也不依赖于Rpml,SGTlb和RAR1。在真核生物中,MAPK级联反应信号途径非常保守,是PTI和ETI信号传导的主要途径之一。利用病毒诱导的基因沉默的方式将烟草中的MAPKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK、NTF6、WRKY1和WRKY2等几个与MAPK途径相关的基因沉默后,在烟草上瞬时表达Avh241,发现MAPKKKα、MEK1、 SIPK、NTF6、WRKYl和WRKY2等六个基因沉默后不影响细胞死亡的产生,而MEK2和WIPK沉默后,细胞死亡明显降低。以上结果说明,Avh241被植物识别引起的细胞死亡是不通过R基因及SGTlb和RAR介导的,而是依赖MAPK级联途径中的MEK2和WIPK信号途径。Avh241在大豆疫霉侵染寄主的初期上调表达,这说明Avh241在侵染过程中应该有比较重要的作用。为了确定在侵染寄主大豆时,Avh241对大豆疫霉毒性的贡献,我们利用PEG介导的原生质体转化技术将大豆疫霉中的Avh241基因进行沉默,得到了三个沉默转化子。对致病性测定发现,转化子致病力下降。这表明在侵染过程中,Avh241具有毒性功能。为了进一步验证Avh241的毒性功能,我们在烟草中瞬时表达Avh241(通过Avh172抑制其诱导的细胞死亡活性),能够促进辣椒疫霉对烟草的侵染。通过检测Avh241的突变体Avh241.4(80.188aa),发现它也能够促进辣椒疫霉对烟草的侵染。Avh241-4不定位到细胞膜上,而且也不能够被植物识别引起细胞死亡。表明Avh241毒性功能是不依赖于它的细胞膜定位功能的。因此,Avh241在病原菌侵染植物的过程中具有毒性功能,并且这种毒性功能不依赖于RxLR motif以及细胞的膜定位。