目的:无血清培养基在生物学基础研究、生物药物以及疫苗生产等领域的应用日益广泛。HEK293-6E是能够表达高品质重组蛋白的人源细胞,但其无血清培养基价格昂贵,而且重组蛋白产量也有进一步提升的空间。本研究旨在建立并优化低成本、高效率、无血清培养HEK293-6E瞬时表达系统,以期表达包括类器官培养所需生长因子的多种高品质重组蛋白。方法:（1）利用细胞培养基成分替换和细胞驯化方法,使HEK293-6E适应于本课题自主建立的无血清培养基;通过对动物源牛血清白蛋白（BSA）的替换或去除,引入水稻源重组人血清白蛋白（HSA）或多胺类化合物腐胺（Putrescine）的探究,进一步对培养基进行优化,并通过优化补料方案以延长细胞生长时间;（2）通过CCK-8、台盼蓝染色后细胞计数,以及光学显微镜下细胞形态的观察评估HEK293-6E培养状态;（3）利用分子克隆技术构建p TT5/GFP重组表达质粒,以该质粒为报道基因,通过蛋白免疫印迹法分析不同转染试剂以及转染质粒与转染试剂不同比例对重组GFP蛋白表达水平的影响,并评估该系统的胞内重组蛋白表达水平;（4）利用分子克隆技术将生长因子Noggin的天然信号肽分别置换为IFNα-2、Ig G重链或Gaussia荧光素酶信号肽,并在Noggin读码框的羧基端置入6个组氨酸的鉴定/纯化标签,以获得四种不同信号肽的p TT5/Noggin重组表达质粒。利用上述建立的HEK293-6E瞬时转染方案,将质粒分别转染HEK293-6E,利用蛋白免疫印迹法分析不同信号肽对Noggin胞外分泌表达的影响;（5）利用上述建立的HEK293-6E瞬时表达方法以及补料培养方案,转染携带优势信号肽的p TT5/Noggin重组质粒,进行1L体系的Noggin重组蛋白表达,利用金属镍亲和层析法纯化Noggin蛋白,并利用小鼠小肠隐窝干细胞类器官培养方法评估Noggin重组蛋白活性。结果:（1）HEK293-6E逐步适应自主建立的无血清培养基,其细胞活力、增殖速度和细胞形态均与商品化培养基无明显差异;100 mg/L HSA能有效替代原培养基中BSA,而且Putrescine也能有效支持细胞生长。（2）在细胞培养至第3天,补充营养成分0.2923 g/L谷氨酰胺、1.74 g/L蛋白水解物、10%5×无血清培养基可将细胞生长时间从3天延长至8天。（3）成功构建p TT5/GFP重组质粒,以PEI为转染试剂、转染质粒与PEI比值为1/2时转染条件最优,在本系统中重组GFP胞内表达产量达47.85 mg/L。（4）成功构建具有IFNα-2、Ig G重链、Gaussia荧光素酶或Noggin天然信号肽以及羧基端携带6个组氨酸标签的四种p TT5/Noggin重组质粒,在HEK293-6E瞬时表达系统中,Gaussia荧光素酶信号肽对Noggin表达分泌具有较高优势。（5）利用HEK293-6E瞬时表达系统成功表达并纯化重组蛋白Noggin,产量达6.9mg/L,该蛋白与商品化Noggin均能诱导小鼠小肠隐窝干细胞类器官生长。结论:本课题成功研发适合HEK293-6E的自主无血清培养基,且在细胞活力、增殖速度以及细胞形态方面均与商品化培养基无明显差异,大大降低了HEK293-6E无血清培养的成本。利用蛋白水解产物、柠檬酸铁和HSA成功替换原培养基中相应的各生长因子、转铁蛋白和BSA,并且Putrescine也能有效支持HEK293-6E的生长,为建立无蛋白或无动物源蛋白的无血清培养基奠定了基础。成功建立一套适合HEK293-6E的瞬时转染以及营养补给方案,且在该系统下胞内蛋白GFP的表达产量达几十毫克/升,分泌型蛋白Noggin在Gaussia荧光素酶信号肽的条件下分泌表达产量达6.9 mg/L,而且重组Noggin生长因子成功诱导小鼠小肠隐窝干细胞类器官生长,表明Noggin蛋白具备生物学活性。