氧化葡萄糖酸杆菌可不完全氧化多种糖、醇化合物生成相应的醛、酮或酸,是生物工业应用中的重要微生物之一。氧化葡萄糖酸杆菌在代谢过程中利用甘油生成二羟丙酮和甘油酸,产物以二羟丙酮为主。二羟丙酮既是一种多用途的有机合成和医药合成前体,又是一种广泛应用的化妆品原料。底物和产物对细胞生长和催化活性的抑制是制约氧化葡萄糖酸杆菌转化生产二羟丙酮的主要因素。因此,获得能耐受高浓度抑制物、且甘油转化效率高的氧化葡萄糖酸杆菌十分必要,而传统的基因工程手段,特别是在相关分子机理未知的情况下,对提高工业菌株的某些特性(如抑制剂耐受等复杂的表型)上存在一定的困难。本论文采用适应性进化策略,以甘油为菌株生长的唯一碳源,设计不同的浓度梯度以创造筛选压力,在连续批次传代中筛选得到了一株进化菌G. oxydans-adaptive。该菌的甘油转化率和二羟丙酮产率都比出发菌有大幅度的提高,以甘油为碳源的生长较出发菌株也有明显的提高。后续研究表明,进化菌的遗传性状稳定。为了寻找G. oxydans-adaptive甘油利用高效、二羟丙酮高产等优良性状的分子基础,本论文又从细胞形态、基因组、蛋白质组等不同层面对进化菌和出发菌进行了研究,同时结合差异基因功能效应的验证和分析,具体进展如下：首先,荚膜染色实验显示进化菌和出发菌都有荚膜,但前者更明显；实时定量PCR结果进一步证明进化菌中多个与荚膜产生相关的基因(gox1483, gox1485, gox1486, goxl477, gox1846)的转录水平均相比出发菌提高了10倍左右。荚膜能够帮助细菌对抗外界环境对细胞的生存威胁,流式细胞仪检测静息细胞催化甘油在24h后的细胞存活率,结果显示适应性进化菌的细胞存活率是出发菌的1.46倍。扫描电镜观察到进化菌与出发菌的细胞聚集状态不同,进化菌细胞较分散且边缘圆润,出发菌则因聚集状态不规则而表面粗糙。透射电镜显示适应性进化菌细胞膜厚度是出发菌的2倍以上。适应性进化导致氧化葡萄糖酸杆菌的荚膜和细胞膜厚度的变化说明了细菌在响应外界环境变化时的自我保护机制。其次,对进化菌G. oxydans-adaptive进行基因组重测序,单碱基的测序深度平均达到370,全基因组覆盖度达98.58%。基因组长度为2702173bp,GC含量为61.73%,开放阅读框2631个,基因组编码密度为90.82%。利用比较基因组学研究工具,发现11个SNP位点,15个短片段插入缺失位点,105个差异基因,未发现基因重排现象。对适应性进化过程可能影响到的差异基因进行分析,发现适应性进化菌的ABC转运系统有5个相关基因发生了变化,2个双组分调节子基因变异,这对进化菌甘油利用能力可能有促进作用；位于细胞膜上的乙醛脱氢酶细胞色素c亚基(gox0585)基因产生了17个错配和10个gap,该基因被认为是负责甘油转化生成甘油酸,而进化菌甘油酸的产生只是痕量,该基因的变异可能与进化菌专一性高产二羟丙酮的机制相关。第三,甘油脱氢酶是负责甘油转化为二羟丙酮的关键酶,实时定量PCR结果显示G. oxydans-adaptive甘油脱氢酶大小亚基的转录水平均提高十倍以上。通过双相电泳和iTRAQ-nano-LC-MS测定了进化菌与出发菌的总蛋白表达情况,显示甘油代谢相关的酶如膜结合的二羟丙酮转运蛋白和胞内二羟丙酮激酶的蛋白表达量都有明显的提高,这暗示了进化菌抵御二羟丙酮对细胞破坏的能力有所增强；甘油-3-磷酸脱氢酶、双组分调节子、过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶等蛋白上调表达,是进化菌对抗氧压力的细胞响应机制；ATP合成相关蛋白、与产能相关的无机焦磷酸酶、胞内NADPH产生、转氢酶等蛋白水平都比出发菌有不同程度提高,表明进化菌的能量及胞内还原力的产生能力增强。G. oxydans-adaptive细胞膜中铁硫亚基蛋白表达水平提高,该蛋白参与电子传递过程,是膜结合脱氢酶快速氧化能力的体现。综合蛋白水平差异,除了膜结合的甘油脱氢酶表达的上调,胞内还原水平的提高是适应性进化菌较出发菌最明显的蛋白水平差异,进化菌表现了较高的能量合成水平。第四,根据进化机制的解析,结合细胞内氧化还原平衡的稳态需求,构建DHA高产菌株可通过促进胞内还原力产生而促进细胞膜上的甘油氧化进程。以此设计实验,通过调节G. oxydans胞内的硫胺素焦磷酸(TPP)含量或TPP的合成能力,改变细胞的生长和／或甘油氧化活性。通过向培养基中或静息细胞催化体系中添加TPP,可使出发菌G. oxydans DSM2003的生长和甘油转化均有一定的提高；在G. oxydans DSM2003中表达TPP合成途径中的硫胺素单磷酸激酶gox2416,重组菌的生长和催化也得到了提高。gox2416基因在G. oxydans-adaptive中同源表达,也取得了相似的结果,重组菌培养时菌体浓度提高了25%,发酵法DHA产率提高了5%,甘油完全转化的时间较G. oxydans-adaptive缩短了约一个小时。在G. oxydans-adaptive中同源表达硫胺素单磷酸合成酶gox0229基因,也使得重组菌的DHA产率提高15%,甘油完全转化的时间较G. oxydans-adaptive缩短了2个小时,但是重组菌的生物量则减少了22%。在G. oxydans-adaptive中串联共表达gox2416和gox0229, DHA产率提高了约20%,生物量减少更加明显,降低了38%,这说明通过同源过表达TPP合成途径的关键基因,可使发酵过程中更多的甘油向产物DHA转化,在一定程度上提高了单位菌体的生产能力。第五,在基因组重测序和蛋白表达谱研究中,发现氧化葡萄糖酸杆菌胞内大量的氧化还原酶以及未鉴定功能的假定蛋白出现变异或表达水平的差异。细胞内还原力水平的变化,将影响依赖NAD(H)、NADP(H)的氧化还原酶生理功能的发挥。本论文选取了其中的3个酶进行催化功能的研究。Gox2181是一种严格依赖NADH的短链醇脱氢酶,具有微弱的甘油氧化活性以及二羟丙酮还原活性,且在进化菌G.oxydans-adaptive中该蛋白的表达水平比出发菌提高了12%,说明该酶与胞内二羟丙酮代谢相关,同时与进化菌对胞内还原力NADH的高需求相关。Gox2036和Gox0644对甘油和二羟丙酮均无活性,与适应性进化过程无直接关联,但其广泛的底物谱体现了应用方面的潜力。除了对这些酶的生理功能的揭示以外,催化底物谱的研究也显示了这3个酶在有机合成或药物合成中的潜在应用,因此,我们解析了它们的晶体结构,为后续的功能开发和理性改造奠定了基础。