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石油从开采到最终使用的各个环节中导致的石油泄漏已造成严重的环境污染,微生物修复技术是治理石油环境污染最有前景的方法,掌握菌株的烷烃降解机理,是后期构建基因工程菌及利用该技术的关键。Dietzia属菌具有广谱的烃类降解能力和良好的高盐、高碱耐受能力,已成为研究放线菌烷烃降解的模式菌株。本研究以大庆油田分离的Dietzia sp.DQ12-45-1b为研究菌株,利用双质粒系统pTip-ist AB-sacB和pRTSK-sacB,构建了库容为30,720的随机突变体文库。随机挑选的突变克隆及突变克隆传代20次后的Southern blot结果表明:转座序列插入的随机性较好、均为单插入突变,并且该突变文库具有较好的遗传稳定性,可用于长期筛选功能基因。我们设计了高通量的正十六烷降解利用基因筛选方法,经过固体培养基初筛、固体培养基复筛、液体培养基复筛多重筛选,成功筛出Dietzia sp.DQ12-45-1b的七个降解利用正十六烷相关功能基因:Contig3-orf00026(编码DUF4263结构蛋白)、Contig8-orf00015(编码假定蛋白)、Contig8-orf00068(编码铁氧化还原蛋白)、Contig8-orf00071(编码烷烃羟化酶CYP153)、Contig8-orf00074(编码铁氧化还原蛋白还原酶)、Contig46-orf01661(编码ABC转运蛋白)、Contig46-orf04630(编码假定蛋白)。通过敲除基因组上目的基因,获得的敲除菌株进行生长曲线及正十六烷降解率测定实验,结果表明DQ12-45-1b野生型菌株的降解率为91.17±4.70%;DQ12-45-1b野生型菌株与敲除菌株Δ3-26、Δ8-15、Δ8-68、Δ8-71、Δ8-74、Δ46-1661、Δ46-4630有统计学上的显著差异(P<0.05),其中,敲除菌株中Δ3-26的降解率最高,为83.70±6.10%;Δ8-68的降解率最低,为15.92±1.82%。该结果表明了这7株敲除菌株中被敲除的基因均与正十六烷降解利用相关。通过构建基因Contig8-orf00068、Contig8-orf00071和Contig8-orf00074的回补菌株,进行生长曲线及正十六烷降解率测定实验,结果表明降解系统的核心并非烷烃羟化酶CYP153,而是负责传递电子的铁氧化还原蛋白。同时,在Dietzia sp.DQ12-45-1b中,细胞色素P450类CYP153烷烃羟化酶可能与膜整合烷烃羟化酶AlkB共同使用一套电子传递体系。