【摘 要】
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β-伴大豆球蛋白是由α′(76k Da)、α(72k Da)和β(54k Da)三个亚基组成的一种重要的大豆抗原蛋白,可引起仔猪和其他动物严重的过敏反应,如腹泻、生长机能下降甚至死亡。亚基三聚体中,β亚基最为稳定,不易去除,是主要的营养抑制剂之一,可用于评价β-伴大豆球蛋白的含量水平。然而,目前并没有有效的方法可对其进行快速检测。因此,本研究拟设计一种高效、稳定、简便的β亚基检测方法用于大豆及其副
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β-伴大豆球蛋白是由α′(76k Da)、α(72k Da)和β(54k Da)三个亚基组成的一种重要的大豆抗原蛋白,可引起仔猪和其他动物严重的过敏反应,如腹泻、生长机能下降甚至死亡。亚基三聚体中,β亚基最为稳定,不易去除,是主要的营养抑制剂之一,可用于评价β-伴大豆球蛋白的含量水平。然而,目前并没有有效的方法可对其进行快速检测。因此,本研究拟设计一种高效、稳定、简便的β亚基检测方法用于大豆及其副产品的品质把控。首先根据等电点不同,采用等电点沉淀法分离纯化得到7S球蛋白β-伴大豆球蛋白。在β-伴大豆球蛋白中,α′和α亚基是亲水性多肽,β亚基是疏水性多肽且分子质量存在差异,故使用苯基疏水柱和葡聚糖凝胶柱(Sephadex 200)依次纯化得到β亚基,利用Quantity One软件和Bradford法分别计算β亚基样品的纯度(97.8%)和质量浓度(0.6g·L-1),均达到适配体筛选的要求。然后使用高亲和力修饰适配体筛选试剂盒X-Aptamer,经过初筛和复筛,获得与β亚基特异性结合的适配体。将结合的序列解离并洗脱进行二代测序,得到丰度最高的10条序列,其平均长度在40 bp左右。选取丰度最高的序列命名为βA-1,实时荧光定量PCR(Real-time Quantitativepolymerase chain reaction,q PCR)测定发现βA-1和β亚基的解离常数(Kd)为6.9 nmol·L-1,表明筛选获得的适配体βA-1具有较高的亲和力,可用于适配体传感器的建立。使用最优的βA-1适配体序列结合纳米金(Gold nanoparticles,AuNPs)比色法设计了一种检测β-伴大豆球蛋白β亚基的传感器。得到最佳的检测条件为:AuNPs比例为62.5%,Na Cl的浓度为0.3 mol·L-1,适配体浓度为0.5μmol·L-1。利用构建的AuNPs-适配体传感器对纯化的β亚基进行检测,当β亚基浓度在0-87 nmol·L-1范围内时,A600/A520随着β亚基浓度的升高而增大,并在7-57 nmol·L-1范围内呈现良好的线性关系(R~2=0.98),检测限为2.58 n M(3S/N)。随后又对传感器的专一性进行验证,发现干扰蛋白对传感器的响应较小,表明该方法具有较好的特异性。将终浓度为20、50、70 nmol·L-1的β亚基分别加入到稀释的豆浆溶液中来验证该方法的实用性,利用上述传感器进行计算,豆浆样品中的β-伴大豆球蛋白β亚基的回收率为95.55%-104.88%,表明该方法能够较好地应用到实际样品的检测。最后,利用碱性蛋白酶酶解模拟豆粕发酵处理验证该传感器对实际样品检测的操作可行性,在此基础上对关键影响因素进行分析,最终用于菌酶协同发酵豆粕样品的评价。适配体传感器对发酵豆粕样品中β-伴大豆球蛋白β亚基检测的最佳稀释倍数为10-50倍,经过菌酶协同发酵24 h后,豆粕β-伴大豆球蛋白β亚基降解率为87.81%,较单独以碱性蛋白酶处理时提高了6.91%,表明适配体传感器可用于发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白β亚基的检测。
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