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华支睾吸虫成虫长期寄生于肝胆管部位所引起的疾病称华支睾吸虫病，又称肝吸虫病，是一种食源性的人兽共患寄生虫病。
华支睾吸虫成虫轻度感染不会产生明显临床症状，易被忽视，患者长期带虫，虫体的分泌/代谢产物及虫体本身的机械刺激，对肝胆系统造成慢性损害，可引起胆管局限性扩张、胆管上皮增生、管壁增厚、管腔狭窄、胆管炎、胆管肝炎和肝硬化甚至诱发肝胆管肿瘤。
流行病学调查结果显示：华支睾吸虫病并发胆管癌的发生率高达14％-47.6％，并且流行区胆管癌较肝细胞癌更多见；病理学资料表明：华支睾吸虫成虫可引起胆管上皮脱落，胆管腺瘤样增生和炎症反应，晚期在腺瘤样增生边缘出现鳞状化生，胆管的腺瘤样增生组织产生退化及纤维化和恶性变；我国珠江三角洲地区的胆管癌患者很多都合并华支睾吸虫感染，有的甚至在癌组织切片中找到华支睾吸虫卵碎片，此种癌多数为低分化癌。
人鳞状上皮癌肿瘤相关基因(squamouscellcarcinoma-relatedoncogene，SCCRO)研究发现，该基因定位于人类染色体3q26.3上，氨基酸序列含有螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链结构，此结构与核转录因子类癌基因相类似，具有潜在转录因子作用。SCCRO转染的裸鼠具有形成未分化侵袭瘤的作用，并且与局部的淋巴结转移相关。SCCRO的大量表达与人类多种鳞状上皮癌的侵袭，转移密切相关。
尽管有充分的证据表明，华支睾吸虫的感染是引发肝胆管癌的一个重要因素，但是至今仍缺乏明确的分子水平的实验证据；另一方面，华支睾吸虫是否存在与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因，是否也具有与其相类似的作用?都值得进一步探讨。
研究目的从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因，探讨其与肝胆管癌发生、发展的关系，为华支睾吸虫感染引起肝胆管肿瘤提供分子生物学依据，同时丰富华支睾吸虫基因组学和功能基因组学研究。
研究方法1华支睾吸虫CsSCCRO基因的发现和生物信息学分析从华支睾吸虫成虫cDNA文库测序后unigene归并、拼接，获得与人鳞状上皮癌相关肿瘤基因相类似的基因，暂命名为CsSCCRO。测序、分析是否为全长基因，然后利用生物信息学分析软件对此基因的cDNA序列进行结构、性质和功能分析，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析、以及推导的CsSCCRO蛋白的理化性质及空间结构分析。
2华支睾吸虫CsSCCRO基因克隆、表达和Western-blotting鉴定
2.1华支睾吸虫成虫CsSCCRO基因的扩增、克隆
根据目的基因的ORF和原核表达质粒pET-30a(+)设计引物，PCR扩增CsSCCRO基因的cDNA全长编码区。限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅤ双酶切空质粒pET-30a(+)和PCR产物，T4连接酶连接。用PCR、酶切及测序鉴定。
2.2华支睾吸虫成虫CsSCCRO基因的表达和纯化
将pET-30a(+)-CsSCCRO重组质粒转化的大肠杆菌BL-21中表达，IPTG诱导后超声裂解破碎，最后用Ni-NTAAgarose蛋白纯化柱纯化目的蛋白，核酸蛋白定量分析仪DU530(Beckman)测浓度。
2.3华支睾吸虫成虫CsSCCRO蛋白的Western-blotting鉴定采用SDS-PAGE电泳和Westernblotting方法，一抗分别用长期感染华支睾吸虫的猫血清和轻度感染的大鼠血清(均为1：100稀释)，以GST1为阳性对照，来检测CsSCCRO蛋白的免疫原性。
3华支睾吸虫CsSCCRO的细胞生物学功能初步研究
3.1CsSCCRO蛋白刺激大鼠卵圆细胞的作用探讨
将卵圆细胞接种于96孔板，待细胞生长稳定后按一定浓度加入目的蛋白刺激，以PBS为阴性对照进行MTT试验。在细胞生长的12h、24h、36h、48h、60h等五个时间点检测细胞492nm的吸光度，来反映细胞的生长变化；提取实验组和对照组细胞的总mRNA，通过RT-PCR检测肿瘤转移相关基因c-myc和CD44表达量的变化。
3.2将CsSCCRO基因转染入Hela细胞和大鼠肝卵圆细胞作用探讨构建pEGFP-N1-CsSCCRO真核重组质粒，脂质体法转染pEGFP-N1-CsSCCRO入Hela细胞和大鼠肝卵圆细胞，荧光倒置显微镜观察CsSCCRO的表达，为进一步的功能研究打下基础。
研究结果1华支睾吸虫CsSCCRO基因的编码序列结构分析从华支睾吸虫成虫cDNA文库中发现与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因，暂命名为CsSCCRO；CsSCCRO是完整的全长基因，该基因全长1218bp。其ORF含碱基780bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，编码259个氨基酸。其推导氨基酸序列与人鳞状上皮癌基因编码蛋白一致性达到50％，保守功能域分析发现该序列含有螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链结构，与核转录因子类癌基因相似；其编码氨基酸理论分子量为30500，理论PI值5.46。
2华支睾吸虫CsSCCRO基因克隆、表达和Western-blotting鉴定用设计的引物PCR从cDNA文库中扩增CsSCCRO编码区cDNA序列，用琼脂糖电泳鉴定在略大于750bp处，测序确定为780bp。定向克隆获得的重组原核表达质粒pET-30a(+)-CsSCCRO经PCR、双酶切和/或测序证实构建成功。重组质粒在IPTG终浓度1mmol/L，28℃下诱导表达可溶性重组融合蛋白，经SDS-PAGE显示与目的蛋白分子量相符，重组蛋白经亲和层析纯化后得到纯化后的目的蛋白。
Westernblotting证实长期自然感染华支睾吸虫的猫血清能与原核表达的CsSCCRO蛋白相结合，说明在华支睾吸虫长期感染过程中目的蛋白可以刺激机体产生抗体，具有一定的免疫原性。对于轻度感染华支睾吸虫的大鼠血清则不能与目的蛋白相结合，提示目的蛋白不宜作为感染早期诊断分子。
3华支睾吸虫CsSCCRO的细胞生物学功能初步研究
CsSCCRO蛋白刺激大鼠卵圆细胞的MTT结果显示：目的蛋白在适当的浓度下利于细胞大鼠肝卵圆细胞的生长，。半定量PCR结果表明：目的蛋白刺激后c-myc的表达量轻度升高，而CD44表达量则无明显变化。
CsSCCRO能够在Hela细胞中高效表达，而在大鼠肝卵圆细胞中则很难见到绿色荧光蛋白的表达。这一方面可能与CsSCCRO蛋白对大鼠肝卵圆细胞有一定的毒性有关，另一方面，也可能与大鼠肝卵圆细胞自身特性不适于脂质体转染有关。
研究结论1.首次在华支睾吸虫中发现了与人鳞状上皮癌相关肿瘤基因同源性较高的基因，暂命名为CsSCCRO。
2.CsSCCRO蛋白能够促进大鼠肝卵圆细胞的生长，并且使肿瘤转移相关基因c-myc的表达量增加。这提示CsSCCRO在诱导肝胆管癌的发生、发展方面具有一定作用，也说明新发现基因暂命名为CsSCCRO有一定的可靠性。
3.CsSCCRO蛋白能被华支睾吸虫长期自然感染猫血清识别，却不能被短期轻度感染华支睾吸虫的阳性大鼠血清识别。这提示CsSCCRO可能为晚期感染相关因子，是否与感染晚期发生的肝硬化、肝胆管癌有关还有待进一步研究。