肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率在所有恶性肿瘤中居高不下。因此,肝癌是严重威胁我国国民健康的一类恶性疾患。目前对肝癌最有效的治疗手段仍为外科手术切除或肝移植,但相当部分肝癌患者在诊断的时候已丧失手术时机,并且还有部分肝癌患者会经历术后或移植后复发、转移。随着下一代测序技术的发展,多个课题组开展了针对肝癌的全基因组及转录组测序,也从遗传学及表观遗传学角度鉴定了肝癌中众多发生突变或差异表达的基因及相应信号通路。目前研究也逐渐证明RNA转录后调控在基因表达中的重要作用,如RNA可变剪接等在疾病发生发展过程中的作用逐渐被认识。RNA可变剪接作为一种转录后的调节机制,可使同一基因产生不同转录本,进而翻译出不同蛋白,或完全废止其翻译能力而产生不具有蛋白质编码能力的lnc RNA。同一基因通过可变剪接所产生的不同转录本或不同蛋白质可具有不同的作用,甚至完全相反的作用。但目前人们对RNA可变剪接的产生机制的认识尚处于初步阶段。在前期研究中,我们发现一个在胎肝中高表达,成体肝中低表达,肝癌中高表达的癌胚剪接因子MBNL3。进一步功能学研究发现肝癌中MBNL3具有强烈的促癌作用。m6A修饰发挥着重要的生物功能,如促进mi RNA生成、调节RNA结构、影响RNA-蛋白质相互作用、影响RNA的翻译效率、核输出、剪接、稳定性等,也在生物发育、生殖、细胞重编程、生物钟中发挥着重要作用。m6A异常修饰也可促进癌症的发生发展,有望成为癌症的治疗、预后靶点。本研究中,我们探究m6A对MBNL3可变剪接的影响以及下游靶基因可变剪接所产生不同转录本的生物学功能。我们发现,敲低RNA甲基转移酶METTL3和METTL14时,细胞中m6A水平下降,MBNL3对RNA的结合能力减弱;敲低去甲基化酶FTO和ALKBH5时,细胞中m6A水平升高,MBNL3对RNA的结合能力增强。在敲低YTHDC1表达的基础上,升高或降低细胞中m6A水平,MBNL3对RNA的结合能力无明显变化,说明m6A影响MBNL3结合RNA的能力是依赖于YTHDC1的。免疫共沉淀显示MBNL3与YTHDC1相互结合,细胞免疫荧光实验显示MBNL3与YTHDC1均分布于细胞核内,且两者存在明显的共定位。之后,我们通过数据库和前期转录组测序数据筛选得到受m6A、YTHDC1和MBNL3共同调节的下游靶基因CLSTN1。ENCORI数据库中也表明YTHDC1结合于CLSTN1基因的内含子11中,并且根据文献报道的MBNL3结合的motif YGCY,也表明在CLSTN1基因的内含子11中也包含MBNL3的结合模体。Ed U增殖实验、TUNEL凋亡实验、迁移和侵袭实验结果显示,过表达CLSTN1-Long,细胞增殖增强,凋亡减弱,细胞的迁移和侵袭能力增强;敲低CLSTN1-Long,细胞增殖减弱,凋亡增强,细胞的迁移和侵袭能力减弱。过表达CLSTN1-Short,细胞增殖减弱,凋亡增加,细胞的迁移和侵袭能力减弱;敲低CLSTN1-Short,细胞增殖增强,凋亡减弱,细胞的迁移和侵袭能力增强。细胞水平上,CLSTN1-Long和CLSTN1-Short存在相反的生物功能,可能的机制是:有研究表明Galectin-7在肝癌中发挥抑癌的作用,而CLSTN1-Long能够特异性地结合Galectin-7,并将Galectin-7驻留在细胞膜上,影响Galectin-7进入细胞内发挥功能,同时Galectin-7是一个分泌蛋白,通过自分泌调节自身表达,因此,当CLSTN1-Long过表达时,影响Galectin-7的自分泌,进而引起Galectin-7的下调表达,发挥促癌的作用。此外,Galectin-7的过表达能够有效的抑制CLSTN1-Long过表达所导致的促癌作用。CLSTN1-Short能够特异性地与β-catenin结合,抑制β-catenin入核,进而抑制其转录激活因子的作用。此外,ICG-001能够有效的抑制敲低CLSTN1-Short所带来的促癌作用。因此,过表达CLSTN1-Short能够起到抑制肿瘤的作用。综上所述,我们首次对肝癌细胞中m6A通过YTHDC1影响MBNL3的可变剪接的作用机制及功能进行了探究。我们发现了受m6A、YTHDC1和MBNL3共同调节的下游靶基因CLSTN1,其产生的两个转录本CLSTN1-Long和CLSTN1-Short影响细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,但功能相反。我们的研究有助于揭示m6A修饰在肝癌HCC发生发展过程的分子机制,构建的m6A-YTHDC1-MBNL3-下游靶基因可变剪接通路,为肝癌预防和治疗提供可能的分子标志物和可能的药物靶点。