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鸭坦布苏病毒（TMUV）是一种在2010年新发现的病毒，引发鸭产蛋下降、生长阻滞、甚至死亡。近年来，也发现这种病毒感染鸡，对养鸡业造成一定损失，且出现的症状与其它呼吸道病原的感染有许多相似之处。引起鸡呼吸道疾病的病原还有新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）等。目前在很多地区出现了与TMUV的混合感染病例，依靠临床症状已经不能鉴别诊断这几种病原的多重感染。此外，鸡群中也经常存在同一个体在同一时间受到不同的病毒感染的情况。所以，如果能同时检测同一份病料中不同的种类的病毒，将对流行病学调查以及疫病的鉴别诊断起到非常重要的作用。 本研究建立了NDV、IBV、TMUV3种禽类病毒的多重PCR检测方法。通过生物信息学的分析，设计了针对这3种病毒的特异性引物，对PCR的反应条件进行了退火温度与引物浓度的梯度优化，结果显示引物浓度在0.1~10 pmol/μL,退火温度53℃或56℃时，能够清晰扩增出3个病毒基因的条带，分别为386 bp（IBV），588 bp（NDV）和821bp（TMUV）。建立的多重 PCR方法能够准确的扩增出三种病原(NDV、IBV和TMUV)的核酸片段，且没有扩增出其他病原的特异性片段。表明此方法对上述三种病原的检测有很好的特异性。同时，该多重PCR检测方法能同时检测到的NDV、IBV、TMUV三种病毒目的基因的最小浓度分别为1.79 ng/μL、125pg/μL、23.4 pg/μL，表明该多重PCR检测方法具有较高的敏感性。 随后，将本试验建立的多重PCR检测方法对收集的一些临床样本进行检测，可检测出TMUV、IBV、NDV的单独感染及TMUV、IBV与 NDV的混合感染，与经典的鸡胚分离培养结果基本吻合。最后，通过对临床样本的PCR产物进行测序从分子生物学角度验证了本实验结果的准确性。本研究成功建立了多重PCR检测三种禽类病毒的方法，为有效预防、控制和扑灭这些禽类动物的疫病提供技术支撑。