第一部分菊粉通过肠道菌群调节色氨酸代谢对精神分裂症小鼠认知功能障碍和慢性神经炎症的作用研究目的1、探讨菊粉（Inulin,INU）对小鼠精神分裂症（Schizophrenia,SCZ）样认知行为障碍的改善效果,评估其对肠道菌群、炎症指标、神经递质、短链脂肪酸（Short chain fatty acids,SCFAs）和色氨酸（Tryptophan,Trp）代谢的影响以及对脑和肠的病理形态的改善作用。2、进一步分析肠道菌群、炎症因子、神经递质、SCFAs及Trp代谢产物之间的复杂关联,并探讨INU干预后的SCZ模型小鼠,其差异菌群、SCFAs及（或）Trp代谢产物如何通过微生物-肠-脑（Microbiota-gut-brain,MGB）轴减轻系统炎症及抑制小胶质细胞过度激活,减轻神经炎症,并对大脑行为记忆进行调控。研究方法将60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:（a）SCZ模型组:给予MK-801（0.6mg/kg体重,i.p.,14d）,正常饮水;（b）INU+SCZ组:造模后,给小鼠喂食含有INU（2g/kg体重）的饮用水,为期6w;（c）RIP+SCZ组:造模后,将含有利培酮（Risperidone,RIP）（0.1mg/kg体重）的饮用水喂养小鼠6w,作为阳性对照组;（d）CON组:等体积生理盐水（i.p.,14d）,正常饮水。饮水干预6w后,行16S rRNA高通量测序检测小鼠粪便中的差异性菌群;采用高效液相色谱质谱分析法（High-performance liquid chromatography mass spectrometry,HPLC-MS）和气相色谱质谱分析法（Gas chromatography mass spectrometry,GC-MS）分别对肠道、脑组织中的Trp代谢产物以及肠道中SCFAs进行检测。血浆及脑组织中白细胞介素（Interleukin,IL）-1β、IL-10、IL-6和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）,以及神经递质多巴胺（Dopamine,DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）和脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）,均由 ELISA 检测;采用免疫比浊法和鲎试剂分别检测血浆C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的变化;采用流式细胞术检测脑小胶质细胞激活的比例;并对小鼠进行旷场（Open field test,OFT）和水迷宫（Morris water maze,MWM）行为学测试,评估小鼠部分行为和认知功能的改变;以及对脑组织不同部位（海马CA1区、CA3区、DG区和脑前额叶皮质）进行了免疫组织化学检测和Nissl染色等;同时对小肠进行了病理形态学检测,包括HE染色及采用免疫组化技术对肠道紧密连接蛋白（Zonula occludens-1,ZO-1和Occludin）分别进行形态学半定量检测。最后,通过相关性分析分别评估差异性菌群与炎症因子、神经递质、SCFAs及Trp代谢产物之间的相关性,以此证明INU通过肠道菌群调节Trp代谢,并通过MGB轴影响了 SCZ小鼠脑组织小胶质细胞的过度激活,从而对大脑行为记忆功能及慢性低度神经炎症有所影响。结果1、INU可显著改善SCZ小鼠异常行为（自主运动功能减退、焦虑障碍、抑郁行为以及学习记忆受损）,部分逆转空间认知功能障碍。OFT实验结果显示INU+SCZ组小鼠自主运动总距离、外周距离及抬爪次数较SCZ组明显增加;MWM实验结果显示INU+SCZ组小鼠逃逸潜伏期时间明显缩短（P均＜0.05）,且穿越平台次数较SCZ组有增加趋势。2、INU可逆转SCZ小鼠的脑神经元损害,显著增加了 BDNF的表达,并降低了脑5-HT水平（P均＜0.05）,DA水平仅有下降趋势。在Nissl染色中可观察到INU干预组海马CA3区、DG区的神经元细胞尼氏小体异常深染较SCZ组明显改善。3、INU可有效减轻系统炎症和慢性低度神经炎症。INU干预后,血浆LPS、CRP,血浆及脑组织 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 均较 SCZ 组降低（P均＜0.05）。脑组织免疫组化提示INU可显著降低SCZ组小鼠脑皮质及海马CA1区、CA3区小胶质细胞Iba1的表达（P均＜0.05）;流式检测示INU明显降低了 CD11b+CD45+和CD11b+CD45high+脑组织小胶质细胞的比例（P均＜0.05）。4、INU提高了肠道ZO-1和Occludin的表达,减少了肠道粘膜屏障的通透性（P均＜0.05）。5、16S rRNA高通量粪便测序表明:INU通过增加Lactobacillus和Bifidobacterium菌属丰度、降低Akkermansia菌属丰度来调节肠道菌群。差异性菌属与炎症因子和神经递质的相关性分析显示:Lactobacillus和Bifidobacterium均与脑组织5-HT负相关;Akkermansia与BDNF负相关,与脑组织上述炎症因子正相关（P均＜0.05,r绝对值均＞0.46）。6、GC-MS:INU干预可逆转粪便SCFAs中丙酸在SCZ组的升高（P＜0.05）。7、HPLC-MS:INU干预后,肠道粪便和脑组织的Trp代谢产物中朱砂酸（Cinnabarinic,CA）和吲哚-3-乳酸（Indole-3-lactic Acid,ILA）含量均显著性增加,喹啉酸（Quinolinic acid,QA）含量明显下降（P均＜0.05）。8、INU干预后,SCFAs、Trp代谢产物与差异性肠道菌群的相关性分析:除丙酸之外的其他SCFAs均与ILA有正相关趋势。SCFAs均与Akkermansia和Negativibacillus有负相关趋势,其中异丁酸、异戊酸和戊酸分别与Akkermansia显著负相关。Trp 代谢产物中 CA与Bifidobacterium、Butyricicoccus、Rikenellaceae-RC9-gut-group 和 unclassified-f-ⅩⅢ 显著正相关;与 Akkermansia、Erysipelatoclostridium、Negativibacillus、Anaeroplasma、Candidatus-Arthromitus、Roseburia和 unclassified-f-Rikenellaceae 显著负相关。ILA 分 别 与 Erysipelatoclostridium、Rikenellaceae-RC9-gut-group和Turicibacter等菌属显著正相关（P均＜0.05,r绝对值均＞0.54）。9、INU干预后,SCFAs、Trp代谢产物与炎症因子密切相关。脑组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10均与SCFAs中丙酸呈正相关趋势,与己酸呈负相关趋势。Trp代谢产物中CA与上述炎症因子均显著负相关,ILA与TNF-α显著负相关（P均＜0.05,r绝对值均＞0.58）。结论膳食INU通过肠道菌群调节Trp代谢产物,自下而上的通过MGB轴,抑制了慢性低度神经炎症,从而改善了 SCZ小鼠的部分行为认知功能障碍。第二部分色氨酸代谢产物朱砂酸对BV-2细胞的抑炎作用及机制研究目的1、探讨Trp代谢产物朱砂酸（Cinnabarinic,CA）对LPS诱导下小鼠BV-2细胞过度激活的抑制作用,评估其对炎症指标以及对BV-2M1/M2分型极化作用的影响。2、探讨CA对LPS诱导下小鼠BV-2细胞过度激活的抗炎分子机制。给予通路蛋白或者受体相应干预后,评估炎症指标以及通路信号分子的变化。研究方法1、采用低浓度LPS建立BV-2细胞体外神经炎症模型,随机分为CON组、LPS组、LPS+CA干预组和CA组,研究CA在炎症环境下对小胶质细胞的抗炎作用。采用CCK-8试剂盒分别检测不同浓度（1 0μM、30μM、100μM和3 00μM）的CA作用于BV-2细胞的活力,并确定CA对细胞活力无影响的最适浓度。检测一氧化氮（Nitric oxide,NO）的释放,并确定CA对细胞的最适刺激时间。采用ELISA检测炎症因子指标（IL-1β、IL-18和TNF-α）的变化。利用免疫荧光标记诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）和精氨酸酶1（Arginase 1,Arg1）,观察BV-2细胞M1/M2分型极化情况。2、基于LPS刺激BV-2细胞并给予最适浓度CA干预,分别给予代谢性谷氨酸受体 4（Metabotropic glutamate receptors 4,mGluR4）拮抗剂 a-甲基-4-膦苯基甘氨酸（a-Methyl-4-phosphono-phenylglycine,MPPG）、腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase,AC）激动剂毛喉素（Forskolin,FSK）和蛋白激酶 A（Protein kinaseA,PKA）抑制剂N-[2-（对溴肉桂酰氨基）乙基]-5-异喹啉磺酰胺,二盐酸 盐（N-[2-（p-bromocinnamyl amino）ethyl]-5-isoquinoline sulfonamide,dihydrochloride,H89）干预。采用ELISA检测上述炎症因子;检测胞内环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,cAMP）水平变化以及采用 Western blot检测 BV-2 细胞 mGluR4、PKA、核因子-κB p65（Nuclearfactorkappa-B p65,NF-κB p65）和核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白家族pyrin结构域蛋白3（Nucleotide oligomerization domain like receptor proteins family pyrin domain proteins 3,NLRP3）等因子在蛋白水平的表达情况。结果1、CCK8实验结果显示:采用300μM CA干预LPS刺激的BV-2细胞24h,以及100μM和300μM的CA干预48h,均会造成细胞活力明显下降（P均＜0.05）。1 0μM、30μM、100μM CA 分别干预 LPS 刺激的 BV-2 细胞 24h,可显著降低细胞释放NO的量,并持续到48h（P均＜0.05）,故CA最适作用时间为24h,以下均为干预24h的结果。2、ELISA显示:3 0μM CA干预组相对于1 0μM和100μM CA给药组能显著降低IL-18、IL-1β、TNF-α较LPS组的表达（P均＜0.05）;结合NO释放量和CCK8检测结果,最终确定30μM CA为最适。同时,NF-κB p65的Western blot检测结果亦显示30μM CA干预组可明显下调LPS组的高表达（P均＜0.05）。3、免疫荧光定性显示:30μM CA干预组可抑制LPS组Iba1的高表达,并能够激活BV-2细胞上mGluR4。4、免疫荧光双标显示:30μM CA给药组可显著逆转M1型小胶质细胞标志iNOS在LPS组的高表达（P＜0.05）,而M2型小胶质细胞标志Arg1的表达较LPS组无显著变化。5、在LPS+CA组的基础上分别给予MPPG、FSK和H89干预,可见BV-2细胞IL-18、IL-1β表达均显著升高（P均＜0.05）。然而在TNF-α测定中发现mGluR4拮抗剂MPPG不能完全抑制CA的抗炎作用,与LPS+CA组的表达相比仅存在上升趋势。6、BV-2细胞内cAMP的改变趋势和炎症因子相似,即分别给予MPPG、FSK和H89干预30μM CA给药组后,与LPS+CA组相比,胞内cAMP水平均显著升高（P均＜0.05）。7、Western blot结果表明,30μMCA能激活mGluR4并显著性降低LPS引起的PKA、NF-κB p65和NLRP3的高表达,在此基础上分别给予MPPG、FSK和H89干预后,较LPS+CA2组相比,PKA和NLRP3均显著性升高（P均＜0.05）,NF-κB p65的表达仅有升高趋势。结论Trp代谢产物CA可通过激活mGluR4在LPS诱导的BV-2神经炎症模型上抑制AC-cAMP-PKA-NF-κB/NLRP3通路,以此逆转小胶质细胞过度激活并使小胶质细胞由M1型向M2型极化,从而抑制神经炎症的发生发展。