BMSCs与破骨细胞通过Wnt5a/NF-κB/MAPK信号串扰并调控大鼠膝骨关节炎软骨下骨重塑的机制研究

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目的观察内侧半月板失稳诱导的SD大鼠膝骨关节炎中软骨下骨重塑的变化;探讨BMSCs与破骨细胞相互串扰调控大鼠膝OA软骨下骨重塑的机制。方法第一部分:内侧半月板失稳诱导的SD大鼠膝骨关节炎中软骨下骨重塑的变化将48只10周龄雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)和DMM模型组(DMM组),DMM组接受内侧半月板失稳术建立OA模型。各组于术后2、4、8、12周取6只大鼠麻醉下心脏取血,处死大鼠,取膝关节。Elisa实验检测血清中骨转换标志物PINP和CTX-I的变化;micro-CT检测软骨下骨显微结构的变化;HE染色和番红-固绿染色检测关节软骨的退变程度;TRAP染色检测软骨下骨中破骨细胞的形成;将另外12只10周龄雄性SD大鼠随机分为Sham组和DMM组,术后4周RT-qPCR检测各组软骨下骨中与骨重塑相关的Wnt基因的表达。第二部分:骨关节炎早期软骨下骨中Wnt5a的表达及破骨细胞的分化术后4周,应用免疫组织化学染色、Western blot、RT-qPCR检测软骨下骨中Wnt5a及破骨细胞相关蛋白和mRNA,包括RANKL、CXCL12、NFATc1、TRAP等的表达;应用全骨髓机械分离联合差速贴壁法分离、培养并纯化原代BMMs和BMSCs,TRAP染色检测BMMs向破骨细胞分化的能力,TRITC标记的鬼笔环肽检测F-actin环的形成,结晶紫染色检测BMMs的迁移和粘附能力,免疫荧光、流式细胞术、茜素红染色和油红O染色鉴定并检测BMSCs的纯度;Western blot检测各组BMMs和BMSCs来源的Wnt5a的表达。第三部分:BMSCs与破骨细胞通过Wnt5a/NF-κB/MAPK串扰并调控大鼠膝骨关节炎软骨下骨重塑的机制研究应用慢病毒转染技术构建表达不同水平Wnt5a的BMSCs,分为NC组、EV组、Ad-Wnt5a组、siRNA-Wnt5a组;CCK-8检测慢病毒转染对BMSCs增殖的影响,确定合适的MOI;免疫荧光、Western blot、RT-qPCR检测慢病毒转染效率及破骨细胞分化相关蛋白的表达;Transwell小室构建BMSCs与RAW264.7的共培养体系,结合结晶紫、TRAP、TRITC标记的鬼笔环肽、甲苯胺蓝染色方法、骨磨片和SEM检测RAW264.7的迁移、分化和骨吸收功能。结果第一部分:内侧半月板失稳诱导的SD大鼠膝骨关节炎中软骨下骨重塑的变化HE染色显示术后2周Sham组与DMM组的CC/TAC分别为(32.15±1.84)%和(34.11±2.46)%,差异无显著性(P=0.3569);至术后8周时,Sham组与DMM组的CC/TAC分别为(32.87±2.15)%和(85.79±1.67)%,差异有显著性(P<0.001)。番红-固绿染色显示DMM组术后2、4、8、12周时的OARSI评分分别为 1.26±0.06、2.37±0.32、5.04±0.38 和 8.00±0.77,与 Sham 组比较均具有显著性差异(P均<0.001)。micro-CT显示与Sham组相比,DMM组在术后4周以内软骨下骨量逐渐减少,术后4周时DMM组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、CD均低于Sham组,而Tb.Sp高于Sham组,均具有显著性差异(P均<0.001)。术后8周时,软骨下骨发生硬化,BV/TV和Tb.Th逐渐增加且高于Sham组(P均<0.05),Tb.N和CD持续降低(P均<0.001)。Elisa结果显示DMM组大鼠血清中CTX-I的含量在术后2周至4周持续增高,术后4周至12周逐渐下降,但一直高于Sham组水平(P均<0.001)。DMM组大鼠血清中PINP的含量在术后2周至4周开始增高,但与Sham组相比无显著性差异(P均>0.05),术后4周至12周持续升高,术后12周PINP的含量显著高于Sham组(P<0.001)。TRAP染色结果显示,术后2周和4周时,DMM组大鼠软骨下骨中破骨细胞数量显著高于Sham组(P均<0.01);之后破骨细胞的数量逐渐下降,至术后8周和12周时与Sham组无显著性差异(P均>0.05)。RT-qPCR结果显示,术后4周DMM组软骨下骨中Wnt5a的mRNA表达水平显著高于Sham 组(P<0.001)。第二部分:骨关节炎早期软骨下骨中Wnt5a的表达及破骨细胞的分化术后4周,与Sham组相比,免疫组织化学染色结果显示,DMM组大鼠软骨下骨中Wnt5a+细胞的比例升高至(60±4.53)%,RANKL+、CXCL12+和NFATc1+细胞的比例分别为(72±2.26)%、(83.8±2.28)%和(77.6±2.07)%,显著高于Sham组(P均<0.001);Western blot和RT-qPCR显示DMM组软骨下骨中Wnt5a的蛋白表达水平增加至Sham组的3倍,破骨细胞分化相关的蛋白和mRNA的表达水平均显著增加(P均<0.001),来源于BMSCs的Wnt5a显著高于BMMs(P<0.001);应用全骨髓机械分离联合差速贴壁法获得的BMMs能够诱导分化为TRAP+、富含F-actin环的多核破骨细胞,获得的BMSCs的在P3代时增殖能力最强,纯度在90%以上;术后4周DMM在不影响BMMs增殖能力的情况下促进BMMs的分化、迁移和粘附能力(P均<0.001)。第三部分:BMSCs与破骨细胞通过Wnt5a/NF-κB/MAPK串扰并调控大鼠膝骨关节炎软骨下骨重塑的机制研究CCK-8、免疫荧光、流式细胞术结果显示MOI=100时慢病毒转染不影响BMSCs的增殖,成功转染细胞的比例达(91.53±3.72)%。Western blot结果显示与NC组BMSCs的Wnt5a表达水平相比,EV组无差异(P=0.99),Ad-Wnt5a组显著增高至NC组的4倍,而siRNA-Wnt5a组显著降低至NC组的1/4(P均<0.001),RT-qPCR检测结果显示各组BMSCs中Wnt5a的mRNA表达水平与上述结果相一致。与NC组相比,Ad-Wnt5a组BMSCs来源的Wnt5a显著增强RAW264.7细胞的迁移、分化和骨吸收能力(P均<0.001),向Ad-Wnt5a组中加入AMD3100或OPG,可以将RAW264.7细胞的迁移、分化和骨吸收能力降低至siRNA-Wnt5a组水平(P均>0.05)。Western blot结果显示,与EV组中BMSCs相比,Ad-Wnt5a组中RANKL的表达被NF-κB、ERK、JNK的抑制剂显著抑制,CXCL12的表达被NF-κB、p38、JNK的抑制剂显著抑制(P均<0.001)。结论在骨关节炎早期,软骨下骨中的破骨细胞介导的骨吸收增强,骨重塑失衡,骨量减少;BMSCs与破骨细胞相互串扰,通过Wnt5a/NF-κB/MAPK信号上调CXCL12和RANKL的表达,促进破骨前体细胞的迁移和分化,调控骨关节炎早期软骨下骨重塑。
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