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背景与目的缺血性脑血管病是全球死亡率和长期致残率的主要原因,具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点,已严重威胁到人类的生命和健康。缺血性脑卒中的发生过程中涉及多种病理生理学机制,包括氧化应激,炎症反应,血管内皮细胞及微血管功能障碍,细胞坏死、凋亡等,其中血管内皮细胞损伤及微血管障碍是主要机制。在大脑血管阻塞后数分钟,即可迅速启动一系列脑缺血生物化学级联反应,炎性因子的释放:肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白介素-10(Interleukin-10,IL-10),白介素-1(Interleukin-1,IL-1),白介素-20(Interleukin-20,IL-20),白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等因子。其中,白介素-10是主要的抗炎和神经营养因子,通过抑制多种促炎因子如TNF-α,IL-1β,IL-8的产生发挥抗炎作用。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是非常重要的神经营养因子之一。在脑缺血损伤后VEGF水平上调已在动物模型中证实。由于复杂的病理生理学机制,治疗缺血性脑卒中已成为临床工作的重点。近年来,关于中药在急性脑缺血损伤的治疗方面研究非常活跃,传统经典中药丹参已广泛应用于临床治疗多种微循环障碍相关疾病,如:心血管疾病,脑血管疾病,肾脏功能障碍,肝纤维化及糖尿病并发症等,具有多靶点、多途径等特点。注射用丹参多酚酸(Salvianolate lyophilized injection,SLI))是丹参的水溶性提取物,具有多种药理活性,主要由丹酚酸B(salvianolic acid B)、丹酚酸D、丹酚酸E、迷迭香酸等组成,已有研究证实丹参多酚酸可通过血脑屏障,降低大鼠脑组织缺血面积,清除自由基,抑制炎性细胞浸润,改善循环等达到治疗急性脑缺血目的。目前丹参多酚酸在急性脑缺血的抗炎及血管保护研究尚少见,本实验通过采用经典的大鼠左侧大脑中动脉闭塞模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),给予注射用丹参多酚酸腹腔注射(30mg/Kg),并选取6h、12h、24h、48h四个不同缺血时间点,通过应用Zea-Longa法评估注射用丹参多酚酸对急性脑缺血大鼠神经功能缺损,TTC染色观察注射用丹参多酚酸对MCAO大鼠脑梗塞体积影响,HE染色观察缺血半暗带区神经细胞形态学变化,酶联免疫吸附测定法(ELISA),蛋白质印迹技术检测方法(Western Blot),免疫组织化学检测法检测注射用丹参多酚酸对MCAO大鼠的血清及脑组织中VEGF、IL-10表达水平的影响,以证实丹参多酚酸在急性脑缺血中发挥的抗炎及血管神经保护作用。材料与方法选取健康雄性SD大鼠(体重250-280g)120只,清洁级,由郑州大学实验动物中心提供,随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO组)、丹参多酚酸治疗组(MCAO+SLI组),再按缺血时间随机分为6h、12h、24h、48h 4个亚组。采用改良Longa法制备大鼠左侧大脑中动脉闭塞模型。Sham组除了不结扎血管其余步骤同模型组,大鼠清醒后,在脑缺血不同时间点MCAO+SLI组腹腔注射丹参多酚酸30mg/Kg,MCAO组、Sham组给予等量的生理盐水。分别于6h、12h、24h、48h时间点对三组脑缺血大鼠采用Longa评分法评估大鼠神经功能,1-3分入组,0分、4分剔除;TTC染色法评估脑缺血大鼠脑梗死程度,ELISA法检测血清VEGF、IL-10水平,Western Blot法检测脑组织中VEGF、IL-10的含量,HE染色法观察缺血半暗区神经元形态变化,免疫组织化学法检测脑缺血大鼠脑组织中VEGF、IL-10的表达情况。结果1神经行为评分及TTC染色结果不同时间点,Sham组大鼠神经功能缺损评分为0分;MCAO+SLI组与MCAO组相比,脑缺血后6h、12h神经功能评分无明显差异(P>0.05),24h、48h神经功能评分改善明显,差异有统计学意义(P<0.05)。脑缺血后24小时,MCAO组及MCAO+SLI组大鼠TTC染色结果:左侧大脑中动脉支配区域均显示白色,但MCAO+SLI组白色区域明显较MCAO组缩小,对侧大脑显示红色;Sham组大鼠左侧大脑中动脉支配区显示红色,对侧大脑显示红色。2 ELISA法及Western Blot检测血清、脑组织VEGF、IL-10的表达ELISA法检测结果:在不同缺血时间点,Sham组血清VEGF、IL-10含量少,MCAO组与MCAO+SLI组含量均较Sham组高(P<0.05),MCAO+SLI组与MCAO组相比,血清VEGF、IL-10水平均升高(P<0.05)。Western blot法检测结果:Sham组大鼠脑组织VEGF、IL-10仅少量表达,MCAO组、MCAO+SLI组VEGF、IL-10的表达6h时开始升高,24h达到高峰,48h稍有下降。各个时间点MCAO+SLI组与MCAO组比较明显升高(P<0.05)。3 HE染色及免疫组织化学染色检测结果HE染色:Sham组大鼠脑组织结构完整,神经元细胞排列紧密,胞核染色清晰,胞质均匀。缺血后梗死灶周围神经元细胞变性坏死,胞核固缩,胞质不均匀。各个时间点,可以看出MCAO组均较MCAO+SLI组坏死的神经元细胞数目增多。免疫组织化学染色结果:镜下观察大鼠左侧皮层缺血半暗带区,Sham组大鼠脑组织VEGF、IL-10仅少量表达,免疫阳性细胞数较少;MCAO组、MCAO+SLI组VEGF、IL-10的免疫阳性细胞数6h时开始升高,24h达到高峰,48h稍有下降,各个时间点MCAO+SLI组与MCAO组比较免疫阳性细胞数均明显升高(P<0.05)。结论1.急性脑缺血可影响大鼠血清、脑组织中VEGF、IL-10的表达,在脑缺血6h、12h、24h、48h,VEGF、IL-10的表达呈现先升高再下降的趋势。2.注射用丹参多酚酸可上调急性脑缺血早期大鼠VEGF、IL-10的表达,减少神经元变性坏死数目,减小梗死面积,改善神经行为学功能。