一株解淀粉芽孢杆菌产谷氨酰胺酶的应用研究

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酱油已成为受世界欢迎的大宗调味品,提高酱油的鲜味就越发受到科技工作者的重视。谷氨酸是重要的鲜味剂,而酱油发酵的高盐环境抑制了米曲霉产谷氨酰胺酶的活力。海洋的高盐环境使得人们将目光转向了海洋来寻求新的发酵菌株。本文采用一株从南海深海海泥中筛选得到的解淀粉芽孢杆菌SWJS22,对其种子液、固体发酵培养基进行优化;将该菌以及该菌固体发酵的新型培养基运用于酱油发酵,以期改善酱油品质;对明显提高酱油鲜味的谷氨酰胺酶进行提取,分离纯化,并探究其酶学性质。本论文的主要研究内容和结果如下:以LB培养基为基础培养基,菌体生物量(OD600)为测定指标,优化了氮源、碳源、金属元素、盐含量,最终确定优化的种子液配方为(%):胰蛋白胨1、酵母抽提物0.5、蔗糖1、Fe2(SO4)3·X H2O 0.01、MnSO4·H2O 0.0001、CuSO4·5H2O 0.0001,且优化后的种子液培养基比LB培养基的菌体生物量提高了171.09%。深入研究了解淀粉芽孢杆菌SWJS22的生理生化特性,结果表明该菌的适应能力强,2 h后开始进入对数生长期,12h后进入稳定生长期,且该菌是一株耐盐菌,而非嗜盐菌。对比解淀粉芽孢杆菌SWJS22的固态和液体两种发酵方式,结果表明固态发酵在产酶上优势明显;通过单因素和正交试验优化其产谷氨酰胺酶的培养基和培养条件,最终确定在料水比1.0:0.6(w/w),SE-1170(蔗糖脂肪酸酯)0.5%(w/w),接种量2.0%(v/w),37℃的条件下,发酵48 h,酶活力可达到2690.02 U/g。以解淀粉芽孢杆菌SWJS22为发酵菌株,与米曲霉复合菌发酵、与米曲霉混曲料发酵的方式来发酵酱油,比较不同制曲方式发酵的酱油之间基本理化指标的差别。试验结果表明:混曲料发酵的酱油,氨基酸转化率最高,总酸含量最低;色泽上与空白对照、6%复合菌制曲发酵的酱油区别明显,色率和色深物质均低于其他发酵方式;6%复合菌和混曲料制曲发酵的酱油比空白对照的还原糖含量有所提高;混曲料发酵和6%复合菌制曲发酵的酱油,谷氨酸含量较空白对照有明显提高。采用GC-MS对比分析三种发酵方式获得酱油的风味物质,结果表明:三种酱油的风味物质种类差别不大,重要风味成分在三种酱油中均有检出;混曲料制曲发酵的酱油,酸类物质的含量最低。对解淀粉芽孢杆菌SWJS22所产的谷氨酰胺酶进行提取、分离纯化和酶学性质的探究,最终确定最佳酶提取料液比为1:8(w/v);提取时间超过1 h后,酶活力变化不显著,趋于平缓。硫酸铵沉淀法较温和,对蛋白影响小,但透析工艺繁杂,对酶活力损失大,且杂蛋白较多;乙醇沉淀法对蛋白质破坏大,但步骤简单易操作,杂蛋白少,提纯倍数高,符合食品工业的要求。解淀粉芽孢杆菌SWJS22所产的谷氨酰胺酶的最适温度为55℃,最适热稳定温度为37℃,最适pH为9.0,最稳定pH为7.0;在NaCl浓度为18%时,谷氨酰胺酶剩余酶活力为80.65%;10%30%的酒精浓度对谷氨酰胺酶活力有促进作用;0.1 mM和1 m M的Ca2+、Li2+、Zn2+、Fe2+、K+、Fe3+、Mg2+均能明显抑制谷氨酰胺酶活力,而在浓度为0.1 mM的Ba2+、Mn2+作用下,谷氨酰胺酶活力受抑制的程度要比在1 mM的浓度下更明显,1 mM的DTT和NaN3使谷氨酰胺酶完全丧失活力。由此可见,解淀粉芽孢杆菌SWJS22所产的谷氨酰胺酶是一种新型的谷氨酰胺酶。
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