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诱导多潜能干细胞(induced Pluripotent Stem cells,iPS)和ES细胞(Embryonic Stem cell,ES)一样具有分化形成三个胚层的细胞的潜能。由于iPS细胞的应用不存在ES细胞所面临的伦理与道德的限制以及免疫排斥的风险,因而其在细胞生物学和再生医学的研究中具有里程碑式的意义。研究发现一些蛋白上具有蛋白转导区域(Protein Transduction Domains,PTD)的小片段,可以穿透细胞膜而将目的蛋白带入到细胞内;这些多肽段中以来自艾滋病病毒HIV的反式激活蛋白(Trans-Activator of Transcription,TAT)和多聚精氨酸(9R)最为常见。本研究构建了重编程因子融合表达载体pTAT-bOct4-9R、pTAT-bSox2-9R、pTAT-Klf4-9R及pTAT-bcMyc-9R,并进行了原核表达研究;同时通过昆虫杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System,BEVS)在Sf9昆虫细胞中表达TAT与重编程因子Oct4、Sox2、Lin28和Nanog等的融合蛋白,为利用TAT和多聚精氨酸(9R)的跨膜作用实现重编程因子蛋白直接重编程牛体细胞提供了科学资料。1.pTAT-bOct4-9R、pTAT-bSox2-9R、pTAT-bKlf4-9R和pTAT-bcMyc-9R原核表达载体的构建及表达研究以NCBI上公布的牛Oct4、Sox2、Klf4和cMyc基因编码区序列为基础,设计并合成含特异的酶切位点和9R的引物;利用PCR扩增方法获得包括Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、TAT和9R的重组DNA序列,并将其克隆到空质粒pTAT-HA上,从而构建pTAT-bOct4-9R、pTAT-bSox2-9R、pTAT-Klf4-9R及pTAT-bcMyc-9R重组表达载体。将经酶切鉴定和测序验证正确后的重组表达载体转化大肠杆菌,设置不同的IPTG诱导浓度和诱导时间,在筛选出的最佳的诱导条件下进行诱导表达,随后对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。成功构建了重组表达载体pTAT-bOct4-9R、pTAT-bSox2-9R、pTAT-bKlf4-9R和pTAT-bcMyc-9R;并发现在IPTG浓度为0.6 mmol/L时于37℃诱导4 h能较好的表达pTAT-bSox2-9R、pTAT-bKlf4-9R和pTAT-bcMyc-9R目的蛋白,其分子量分别为36 kDa、52.6 kDa和50 kDa。该研究结果为PTD介导的重编程因子蛋白直接重编程牛体细胞以获得诱导多潜能干细胞的研究积累了原始资料。2.TAT与重编程因子Oct4、Sox2、Lin28和Nanog的真核融合表达载体构建及其表达以NCBI上公布的人Oct4、Sox2、Lin28和Nanog基因编码区序列为基础,设计并合成含特异的酶切位点、跨膜转导肽TAT的引物;利用PCR扩增方法获得包括Oct4、Sox2、Lin28、Nanog和TAT的重组DNA序列,并将其克隆到空质粒pCR4-TOPO上,经酶切鉴定和测序验证正确后将目的片段克隆至表达载体pBAC-3,并将再次测序验证正确的重组载体命名为pBAC-3/TAT-Oct4、pBAC-3/TAT-Sox2、pBAC-3/TAT-Lin28和pBAC-3/TAT-Nanog。重组质粒转染Sf9细胞,5天后收集重组病毒再次感染新鲜的Sf9细胞,病毒感染72 h后收集细胞培养液并提取细胞的总蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析发现重编程因子Oct4,Sox2,Lin28和Nanog与TAT的融合蛋白均在目的细胞中有表达,TAT-Sox2,TAT-Oct4,TAT-Lin28和TAT-Nanog分子量大小分别是36 kDa,40kDa,24 kDa和36 kDa。蛋白纯化等实验发现所有的重组蛋白均未以分泌蛋白的形式存在,且其绝大部分位于细胞核内而非细胞质中,这些结果均不利于蛋白的纯化和对靶细胞进行重编程的研究。