草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国淡水池塘养殖主要品种之一，养殖过程易受病原体的侵袭而导致病害发生。细菌性肠炎病、烂鳃病、赤皮病，病毒性出血病以及寄生虫病等均可引起草鱼大量死亡，给草鱼养殖业带来巨大损失。本课题组从患类似赤皮病的草鱼体上的分离纯化到一株优势菌株。病鱼体表局部出血发炎，以腹部最为严重，鳍条基部充血、末端腐烂草鱼。本研究对该菌株进行了鉴定，确定其为铜绿假单胞菌，并进行药敏试验分析。同时进行外膜蛋白oprl以及外膜蛋白oprF和oprl融合蛋白的基因工程表达研究，分析其免疫原性，为草鱼铜绿假单胞菌疫苗的开发奠定基础。　　 1病原菌的分离、鉴定和药敏试验分析　　 从患病草鱼体表病灶上分离到一株优势菌，回归感染试验显示该菌株能感染草鱼，且具较强毒力。对该病菌进行形态特征观察和主要理化特性分析，初步鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。进一步对该菌进行分子鉴定，共选用16S rRNA、RNA聚合酶β亚单位(rpoB)和促旋酶亚单位蛋白(gyrB)3个基因进行鉴定分析。序列克隆与BLAST分析显示，这3个基因均与GenBank上登录的铜绿假单胞菌的相应序列具有很高的同源性。16S rRNA基因、rpoB基因和gyrB与已知铜绿假单胞菌相应序列的同源性分别在9g％、98％和93％以上.综合生理生化与分子鉴定结果，可判定所分离的菌株为铜绿假单胞菌.药敏实验显示该菌对阿米卡星、菌必治、氟哌酸和妥布霉素等11种药物高度敏感，对链霉素和庆大霉素中度敏感，对罗红霉素、红霉素、四环素、苯唑青霉素、新霉素和头孢氨苄等16种药物具有耐药性。　　 2外膜蛋白oprF和oprl基因克隆、原核表达质粒构建与表达　　 克隆了铜绿假单胞菌外膜蛋白oprF和oprl基因的完整开放阅读框，并进行了结构与功能预测。预测结果显示oprl的67-252片段、oprF的568-1026片段具有较强免疫原性。利用原核表达质粒pQE30构建带此oprl基因片段的重组表达质粒pQE-oprl，以及带有oprF的568-1026和oprl的67-252串联序列的表达质粒pQE-oprF-I.重组表达质粒分别转化大肠杆菌M15菌株、诱导表达，SDS-FAGE检测到与预期大小相符的蛋白条带，且蛋白均为可溶性表达。经HisBind柱纯化获得重组蛋白F-I和I。　　 3重组外膜蛋白oprI和oprF-I免疫原性分析　　 重组蛋白F-I和I，分别加入弗氏不完全佐剂后免疫草鱼。Western blotting方法检测免疫组草鱼抗体的产生。结果显示重组FI蛋白免疫组在约36kDa和12kDa处的出现特异性条带，重组Ⅰ蛋白免疫组在12kDa处出现单一条带，说明二种重组蛋白均具有较强的免疫原性，诱导产生的抗体能与铜绿假单胞菌中的F和I蛋白特异结合。Elisa检测显示重组F蛋白免疫组草鱼血清抗体滴度达到800，重组Ⅰ蛋白免疫组的达到800，说明受免草鱼均产生了较高的特异性抗体。采用qRT-PCR检测草鱼头肾与脾脏IgM基因和G型溶菌酶基因的mRNA水平。受免组与对照组相比表达水平均有明显上升，其中F组头肾中IgM基因的表达量有显著差异(P＜0.05)；I组头肾中的溶菌酶和IgM基因的表达水平也均显著上升(P＜0.05)。攻毒实验显示二个免疫组均产生了很好的保护作用，相对保护率为100％，而对照组仅为10％。研究结果说明外膜蛋白oprF-I和oprl对草鱼抗铜绿假单胞菌具有很好的免疫保护效果，可作为候选草鱼抗铜绿假单胞菌亚单位疫苗。