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采用分子克隆技术首次获得了斑鳜(Siniperca scherzeri)3种胃蛋白酶原(pepsinogen,PG):PGA1、PGA2和PGC,PGA1和PGC5侧翼区序列以及胃质子泵(gastricH+/K+-ATPase)α、β亚基的基因序列,分析了它们在鳃、食道、胃、幽门垂、前肠、后肠、肝胰脏、肾脏、脾脏、心脏、皮肤、肌肉、卵巢和精巢各组织中表达特征,为进一步研究不同PG的时空表达、功能、激活及其转录调控奠定了分子基础,为鱼类消化生理的分子机制研究提供了新的资料。
采用RT-PCR和RACE等技术克隆了斑鳜3种PG基因(PGA1、PGA2和PGC)cDNA全长序列和DNA序列,结果表明:PGA1cDNA全长序列1361bp,共编码378个氨基酸;PGA2cDNA全长序列1348bp,编码376个氨基酸;PGCcDNA全长序列1505bp,编码387个氨基酸。3种PG的氨基酸序列均由信号肽、激活肽和胃蛋白酶3个部分组成,序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。斑鳜PGA1与其它鱼类的PGA氨基酸序列相似度在77.8%~94.2%之间,与两栖类、鸟类以及哺乳类则在68.8%~74.4%之间;斑鳜PGA2与其它鱼类的PGA氨基酸序列相似度在77.9%~95.5%之间,与两栖类、鸟类以及哺乳类则在68.5%~72.5%;斑鳜PGC与其它鱼类的PGC氨基酸序列相似度在89.1%~92.0%之间,与两栖类、鸟类以及哺乳类则在67.3%~87.9%,斑鳜3种PG与其它脊椎动物间的相似度较高(均大于60%),揭示了它们在进化过程中较为保守。PGA1、PGA2和PGC的DNA序列均由9个外显子和8个内含子组成,除PGC第8内含子剪切位点是GC-AG型外,其它均为GT-AG型。RT-PCR检测了PGA1、PGA2和PGC在各组织中的表达情况,结果显示:3种PG均在食道、胃和皮肤中表达,且主要在食道和胃中表达。此外PGA1还在心脏和精巢中表达,PGA2还在心脏、卵巢和精巢中表达,PGC还在肌肉中表达。
为进一步探讨斑鳜不同PG基因的转录调控差异,运用PCR-末端加尾法分别克隆获得了长2437bp的PGA15侧翼区序列和长1924bp的PGC5侧翼区序列。结果显示:PGA1和PGC的启动子区域均位于-40~+10bp处,PGA1和PGC的启动子区域均存在TATAbox,而无GCbox和CAATbox。在PGA15侧翼区发现10个HSF和CdxA结合位点,在PGC5侧翼区发现10个CdxA结合位点,此外还发现一些其它转录因子结合位点。
由于胃酸的分泌是PG激活的必需条件,因此我们还克隆了斑鳜胃质子泵α、β亚基的cDNA全长序列。结果显示:α亚基cDNA全长3531bp,编码1021个氨基酸,其氨基酸序列含有10个跨膜区,并存在1个赖氨酸/甘氨酸结构簇和1个E1-E2型α亚基转化的磷酸化位点;斑鳜胃质子泵β亚基cDNA序列全长1742bp,编码291个氨基酸,其氨基酸序列由胞质域、膜域和胞浆域3个部分组成,且存在7个N-糖基化位点和6个位置较为保守,形成二硫键的半胱氨酸。斑鳜胃质子泵α亚基与其它鱼类的相似度在92.8%~94.7%之间,与两栖类和哺乳类的相似度在89.7%~93.2%之间;β亚基氨基酸序列与其它鱼类的相似度在89.1%~92.1%之间,与两栖类、鸟类和哺乳类的相似度在60.1%~67.7%之间,说明α、β亚基在脊椎动物长期的进化过程中具有较高的保守性。斑鳜胃质子泵α亚基和β亚基均在食道、胃中有大量表达。其中α亚基除不在肝胰脏和卵巢中表达外,在其它所检测的组织中均表达;β亚基则还在卵巢和精巢中有微弱表达。这为进一步研究该基因与PG的协同表达关系与消化功能分析奠定了分子基础。