白血病是最常见的恶性肿瘤之一，是一组异质性起源的恶性克隆性疾病，年发病率3-4／10万。目前治疗白血病的方法主要是化疗，化疗主要是通过促进白血病细胞凋亡来达到治疗白血病的目的。随着化疗方案的不断改进和新化疗药物的出现，白血病的预后已有非常明显的改善，但仍然存在白血病耐药及停药后白血病复发等问题。例如，多种肿瘤细胞可对抗肿瘤药物诸如长春新碱（VCR）、丝裂霉素C（MMC）和柔红霉素（DAM）等产生耐药性。因此，寻找抗肿瘤新药、探索相关治疗新方案具有重要意义。近年来，某些中药及其有效组分因具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用备受关注。雷公藤泛指卫矛科雷公藤属植物，是我国传统中药材之一。雷公藤红素是雷公藤单体之一，属三萜类色素，分子式为C₂₉H₃₈O₄，分子量为450。有文献报道，雷公藤红素不仅具有免疫抑制和抗炎作用，也可显示体外抗肿瘤活性，但其机制尚未完全明了。本研究以人急性髓系白血病HL-60细胞为靶细胞，采用流式细胞术和透射电镜法等方法，探讨了雷公藤红素诱导HL-60细胞凋亡的量效及时效关系，此外还检测了雷公藤红素处理前后对HL-60细胞Fas、FasL和NF-κBP65表达水平的影响，以期了解雷公藤红素诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。材料和方法1．HL-60细胞培养及处理：24孔细胞培养板中每孔接种1×10⁶／ml的HL-60细胞，37℃、5％CO₂条件下预培养24 h。试验组加入终浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0μmol／L的雷公藤红素，实验中同时设置不加药物的对照组，37℃、5％CO₂培养24 h后收集细胞。另将HL-60细胞与终浓度为1.5μmol／L雷公藤红素分别培养0、4、8、12、16、24 h。所收集的细胞用PBS洗涤2次后重悬，调整细胞浓度为1×10⁶／ml。2．肿瘤细胞杀伤试验采用台盼兰染色活细胞计数法。取30μl不同浓度雷公藤红素处理前后细胞悬液，用台盼蓝染色后镜检100个细胞并计算活细胞百分率，其中拒染细胞为活细胞，染成蓝色的细胞为死细胞。3．肿瘤细胞凋亡检测采用FITC-annexin V／PI流式细胞法。取上述不同浓度雷公藤红素处理及同一浓度雷公藤红素作用不同时间的HL-60细胞悬液100μl，分别加入10μlFITC-annexin V，37℃孵育10 min，PBS洗涤后重悬细胞，加入PI终止液50μl，用流式细胞仪检测。4．透射电镜观察取1.5μmol／L雷公藤红素处理0和24 h的细胞离心后弃上清，沉淀用预冷的0.01 mol／LPBS（pH 7.4）离心洗涤细胞2次，2.5％戊二醛磷酸缓冲液4℃固定细胞4 h，超薄切片后用透射电镜观察细胞形态学变化。5．Fas和FasL检测分别取1.5μmol／L雷公藤红素处理0、12和24 h的细胞悬液100μl，分别加入FITC标记的Fas或FasL单克隆抗体10μl，以IgG1-FITC为阴性对照，37℃孵育30 min后用流式细胞仪检测，分别定量分析不同标本中Fas和FasL阳性细胞百分率。6．NF-κBP65活性的检测分别取1.5μmol／L雷公藤红素处理0、12和24 h的细胞悬液100μl，加入兔抗人NF-κBP65单克隆抗体100μl，室温孵育30 min后用PBS洗涤2次，然后加入FITC标记鼠抗兔单克隆抗体，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次，用1％副醛固定细胞后用流式细胞仪检测，定量分析不同标本中NF-κBP65阳性细胞百分率。结果1．不同药物浓度及作用时间与细胞凋亡率变化的关系台盼蓝染色结果表明，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μmol／L雷公藤红素作用24 h后，HL-60活细胞百分率分别为93.1±1.4、92.1±1.1、86.4±1.4、84.1±1.7、80.2±1.5，未受雷公藤红素作用的正常HL-60活细胞百分率为98.3±0.6。流式细胞术检测结果表明，HL-60细胞凋亡率分别为6.13±0.83、14.31±1.35、36.71±2.28、31.85±2.06、20.17±2.19，与对照组1.97±0.64相比其差异有统计学意义（P＜0.05）。其中药物浓度为0.5～1.5μmol／L时，细胞凋亡率随药物浓度的增加而升高，药物浓度≥2.0μmol／L时，细胞凋亡率随药物浓度增加而下降。1.5μmol／L雷公藤红素分别作用4、8、12、16、24 h时，其凋亡率分别为2.67±0.26、7.44±0.66、12.68±1.15、22.10±0.95、38.53±1.83，与对照组1.92±0.26相比差异有统计学意义（P＜0.05）。2．细胞形态学观察结果正常HL-60细胞呈较为均一的圆形或椭圆形。1.5μmol／L雷公藤红素分别处理16和24 h后，均可见细胞圆缩、大量胞浆内空泡，并出现染色体边集、细胞核形成新月体形等典型的细胞凋亡形态学变化，部分细胞细胞核内出现凋亡小体，随作用时间延长上述病变更为明显。3．Fas、FasL和NF-κBP65阳性细胞百分率1.5μmol／L雷公藤红素分别作用12和24 h后，HL-60细胞Fas和FasL表达明显增强，其中Fas阳性细胞百分率分别为47.91±1.21、65.74±1.20，与对照组14.23±1.42相比差异有统计学意义（P＜0.05）；FasL阳性细胞百分率分别为37.92±1.73、43.50±2.11，与对照组15±61±1.10相比差异有统计学意义（P＜0.05）。1.5μmol／L雷公藤红素作用24 h时，NF-κBP65阳性HL-60细胞率为4.78±0.30，与对照组8.34±1.52相比，明显低于对照组（P＜0.05）。结论1．雷公藤红素在一定的浓度范围内（0.5～1.5μmol／L），均可诱导HL-60细胞凋亡并呈浓度依赖效应，且药物浓度为1.5μmol／L时细胞凋亡率最高。当雷公藤红素浓度≥2.0　μmol／L时，HL-60细胞凋亡率不升反降，提示雷公藤红素作用HL-60细胞时，可能存在有效浓度阈值现象。当雷公藤红素浓度为1.5μmol／L时，HL-60细胞凋亡率呈现作用时间依赖效应。2．未经雷公藤红素作用的HL-60细胞Fas及FasL低表达，当细胞受雷公藤红素作用后，其Fas和FasL表达阳性率明显升高，提示诱导靶细胞Fas及FasL表达、继而启动相关胞内致死性信号转导通路，可能是雷公藤红素抗肿瘤作用的机制之一。3．1.5μmol／L雷公藤红素作用24 h的HL-60细胞，其NF-κBP65表达水平明显下降，提示抑制肿瘤细胞NF-κB信号通路可能是雷公藤红素抗肿瘤作用的另一作用机制。