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肝脏移植(Liver Transplantation，LT)是目前治疗终末期肝脏疾病的最佳手段。肝移植手术技术已趋成熟，但是肝脏移植术后患者免疫系统功能紊乱仍是困扰移植界的主要问题。包括移植术后免疫排斥、感染和新发肿瘤等一系列问题亟待解决。通过何种方法合理有效地诱导病人实现术后长期的免疫耐受是目前移植界关注的焦点。
调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，具有负向调节功能。在自身免疫性疾病，肿瘤免疫等方面发挥重要作用，Treg细胞同样被证实可以有效地抑制移植术后免疫排斥反应发生，具有诱导免疫耐受的内在潜能。除去已有的Treg细胞的经典抑制作用途径。Treg细胞还可以高表达免疫共抑制受体以控制效应性T细胞增殖。其中主要包括CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT。大量围绕免疫共抑制受体在肿瘤方面的研究已广泛开展。但尚未有关于免疫共抑制受体在器官移植方面的作用研究。
器官移植术后患者需长期应用免疫抑制剂。免疫抑制剂种类繁多且可以多种组合。鉴于Treg具有强大的诱导免疫耐受的作用，已有实验开展了单一应用输入Treg细胞的方法诱导免疫耐受，但研究结论证实仍旧不可完全停止使用免疫抑制剂。因此通过合理选择的免疫抑制剂，有效的诱导体内自身的Treg细胞增殖将是最为理想的治疗措施。免疫共抑制受体对维持Treg细胞功能至关重要，本实验通过研究不同免疫抑制剂时Treg细胞的变化及作用位点，以期为进一步诱导移植术后免疫耐受提供新的治疗思路。
第一部分不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞的表达影响
目的：研究不同免疫抑制剂下肝移植患者Treg细胞及相关因子的表达情况。
方法：分别提取他克莫司(FK506)单药组、FK506联合霉酚酸酯(MMF)药物组、正常对照组外周血，分离出外周血单个核细胞后，通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+、Treg细胞含量，同时检测不同组别外周血中TGF-β、IL-10和IL-4含量变化。
结果：1.FK506+MMF组患者CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群均高于FK506单药组，CD3+、CD4+T细胞亚群比例均低于对照组，Treg细胞均高于FK506单药组和对照组。2.FK506+MMF组中TGF-β和IL-10含量均高于FK506单药组。IL-4含量三组之间无差异。
小结：FK506联合MMF可以增加肝移植术后患者Treg细胞含量。同时增加TGF-β和IL-10细胞因子含量。
第二部分不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞功能的影响
目的：研究不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞抑制功能的影响。
方法：收集FK506联合MMF组、FK506单药组以及对照组的外周血标本，免疫磁珠法分选出Treg细胞和效应性T细胞(Teff细胞)。以0:1，1:4，1:2，1:1不同的比例混合培养，检测Teff细胞的增殖率，计算不同免疫抑制剂下Treg细胞的抑制率。同时检测Teff细胞分泌IFN-γ和TNF-α细胞因子水平。
结果：1.FK506联合MMF组、FK506单药组、对照组Treg抑制率随加入比例增加逐渐增高。至Treg：Teff比例为1:1时Treg的抑制率最高。2.同一比例下FK506+MMF组Treg细胞抑制率均高于FK506单药组和对照组。3.IFN-γ和TNF-α的因子水平均随Treg细胞与Teff的比例增加逐渐下降，同一比例下，FK506联合MMF组IFN-γ和TNF-α细胞因子水平明显低于FK506单药组和对照组。
小结：Treg细胞显著抑制效应性T细胞增殖，且存在浓度依赖性。FK506联合MMF免疫抑制剂显著增强Treg细胞抑制功能。
第三部分不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞中免疫共抑制受体的影响
目的：研究不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞表面免疫共抑制受体表达情况。
方法：分别提取FK506单药组、FK506联合MMF药物组、对照组外周血单个核细胞，通过流式细胞仪标记CD4+CD25+CD127-Treg细胞，然后分别进行CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT染色，比较不同免疫抑制剂条件下各共抑制受体含量变化。
结果：1.FK506联合MMF组中Treg细胞表面各免疫共抑制受体CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT含量均高于FK506单药组与对照组。2.各免疫共抑制受体中以PD-1、TIGIT表达量最强。
小结：FK506联合MMF显著增加肝移植术后患者Treg细胞表面CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT免疫共抑制受体比例，其中尤以TIGIT和PD-1最为显著。可能通过高表达此两种受体影响Treg细胞功能。
第四部分TIGIT和PD-1在肝移植术后患者Treg细胞中的作用
目的：探讨不同免疫抑制剂条件下TIGIT和PD-1对肝移植术后患者Treg细胞的影响。
方法：采用免疫磁珠法分离提取各组人群的Treg细胞和Teff细胞，按照1:1比例配比后分别加入TIGIT功能抗体、PD-1功能抗体、TIGIT和PD-1双抗体，检测Teff细胞的增殖率，计算Treg细胞的抑制率。检测Teff细胞所分泌IFN-γ和TNF-α的因子水平。采用Ancova统计方法比较各组数据差值变化。
结果：1.三组中Treg细胞抑制率均逐渐减弱，Teff细胞分泌IFN-γ和TNF-α的因子水平均逐渐增高。同时阻断TIGIT和PD-1作用强于单一阻断PD-1且强于单一阻断TIGIT。2.相同干预条件下FK506联合MMF组Treg抑制率低于FK506单药组和对照组，Teff分泌IFN-γ和TNF-α的因子水平高于FK506单药组和对照组。
小结：TIGIT和PD-1高表达均强化Treg细胞的抑制功能，且两者存在协同作用。FK506联合MMF可能通过TIGIT和PD-1免疫共抑制受体途径提高了Treg细胞的功能。
结论：
1.FK506联合MMF增加肝移植患者术后Treg细胞比例且显著增强Treg细胞抑制功能，易于诱导肝移植术后免疫耐受。
2.FK506联合MMF可能通过影响Treg细胞表面的免疫共抑制受体尤其是TIGIT和PD-1强化了Treg细胞的抑制功能。为诱导肝移植病人术后免疫耐受提供了新的理论依据及作用靶点。
调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，具有负向调节功能。在自身免疫性疾病，肿瘤免疫等方面发挥重要作用，Treg细胞同样被证实可以有效地抑制移植术后免疫排斥反应发生，具有诱导免疫耐受的内在潜能。除去已有的Treg细胞的经典抑制作用途径。Treg细胞还可以高表达免疫共抑制受体以控制效应性T细胞增殖。其中主要包括CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT。大量围绕免疫共抑制受体在肿瘤方面的研究已广泛开展。但尚未有关于免疫共抑制受体在器官移植方面的作用研究。
器官移植术后患者需长期应用免疫抑制剂。免疫抑制剂种类繁多且可以多种组合。鉴于Treg具有强大的诱导免疫耐受的作用，已有实验开展了单一应用输入Treg细胞的方法诱导免疫耐受，但研究结论证实仍旧不可完全停止使用免疫抑制剂。因此通过合理选择的免疫抑制剂，有效的诱导体内自身的Treg细胞增殖将是最为理想的治疗措施。免疫共抑制受体对维持Treg细胞功能至关重要，本实验通过研究不同免疫抑制剂时Treg细胞的变化及作用位点，以期为进一步诱导移植术后免疫耐受提供新的治疗思路。
第一部分不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞的表达影响
目的：研究不同免疫抑制剂下肝移植患者Treg细胞及相关因子的表达情况。
方法：分别提取他克莫司(FK506)单药组、FK506联合霉酚酸酯(MMF)药物组、正常对照组外周血，分离出外周血单个核细胞后，通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+、Treg细胞含量，同时检测不同组别外周血中TGF-β、IL-10和IL-4含量变化。
结果：1.FK506+MMF组患者CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群均高于FK506单药组，CD3+、CD4+T细胞亚群比例均低于对照组，Treg细胞均高于FK506单药组和对照组。2.FK506+MMF组中TGF-β和IL-10含量均高于FK506单药组。IL-4含量三组之间无差异。
小结：FK506联合MMF可以增加肝移植术后患者Treg细胞含量。同时增加TGF-β和IL-10细胞因子含量。
第二部分不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞功能的影响
目的：研究不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞抑制功能的影响。
方法：收集FK506联合MMF组、FK506单药组以及对照组的外周血标本，免疫磁珠法分选出Treg细胞和效应性T细胞(Teff细胞)。以0:1，1:4，1:2，1:1不同的比例混合培养，检测Teff细胞的增殖率，计算不同免疫抑制剂下Treg细胞的抑制率。同时检测Teff细胞分泌IFN-γ和TNF-α细胞因子水平。
结果：1.FK506联合MMF组、FK506单药组、对照组Treg抑制率随加入比例增加逐渐增高。至Treg：Teff比例为1:1时Treg的抑制率最高。2.同一比例下FK506+MMF组Treg细胞抑制率均高于FK506单药组和对照组。3.IFN-γ和TNF-α的因子水平均随Treg细胞与Teff的比例增加逐渐下降，同一比例下，FK506联合MMF组IFN-γ和TNF-α细胞因子水平明显低于FK506单药组和对照组。
小结：Treg细胞显著抑制效应性T细胞增殖，且存在浓度依赖性。FK506联合MMF免疫抑制剂显著增强Treg细胞抑制功能。
第三部分不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞中免疫共抑制受体的影响
目的：研究不同免疫抑制剂对肝移植术后患者Treg细胞表面免疫共抑制受体表达情况。
方法：分别提取FK506单药组、FK506联合MMF药物组、对照组外周血单个核细胞，通过流式细胞仪标记CD4+CD25+CD127-Treg细胞，然后分别进行CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT染色，比较不同免疫抑制剂条件下各共抑制受体含量变化。
结果：1.FK506联合MMF组中Treg细胞表面各免疫共抑制受体CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT含量均高于FK506单药组与对照组。2.各免疫共抑制受体中以PD-1、TIGIT表达量最强。
小结：FK506联合MMF显著增加肝移植术后患者Treg细胞表面CTLA-4，PD-1，Tim-3，LAG-3，TIGIT免疫共抑制受体比例，其中尤以TIGIT和PD-1最为显著。可能通过高表达此两种受体影响Treg细胞功能。
第四部分TIGIT和PD-1在肝移植术后患者Treg细胞中的作用
目的：探讨不同免疫抑制剂条件下TIGIT和PD-1对肝移植术后患者Treg细胞的影响。
方法：采用免疫磁珠法分离提取各组人群的Treg细胞和Teff细胞，按照1:1比例配比后分别加入TIGIT功能抗体、PD-1功能抗体、TIGIT和PD-1双抗体，检测Teff细胞的增殖率，计算Treg细胞的抑制率。检测Teff细胞所分泌IFN-γ和TNF-α的因子水平。采用Ancova统计方法比较各组数据差值变化。
结果：1.三组中Treg细胞抑制率均逐渐减弱，Teff细胞分泌IFN-γ和TNF-α的因子水平均逐渐增高。同时阻断TIGIT和PD-1作用强于单一阻断PD-1且强于单一阻断TIGIT。2.相同干预条件下FK506联合MMF组Treg抑制率低于FK506单药组和对照组，Teff分泌IFN-γ和TNF-α的因子水平高于FK506单药组和对照组。
小结：TIGIT和PD-1高表达均强化Treg细胞的抑制功能，且两者存在协同作用。FK506联合MMF可能通过TIGIT和PD-1免疫共抑制受体途径提高了Treg细胞的功能。
结论：
1.FK506联合MMF增加肝移植患者术后Treg细胞比例且显著增强Treg细胞抑制功能，易于诱导肝移植术后免疫耐受。
2.FK506联合MMF可能通过影响Treg细胞表面的免疫共抑制受体尤其是TIGIT和PD-1强化了Treg细胞的抑制功能。为诱导肝移植病人术后免疫耐受提供了新的理论依据及作用靶点。