论文部分内容阅读
目的1.研究核糖体S6蛋白激酶4(RSK4)基因甲基化在甲状腺乳头状癌(PTC)中的作用;2.初步探讨PTC中RSK4对Podocalyxin类蛋白(PODXL)的影响。方法1.收集2018年4月至2018年10月在我院接受甲状腺全切及次全切除术的PTC患者癌组织及相应癌旁组织各226例,应用逆转录-定量PCR(RT-qPCR)检测RSK4表达量,一代测序检测癌组织中BRAF V600E突变率,其中134组标本应用甲基化特异性PCR(MSP)、31组标本应用亚硫酸盐基因组测序法(BGS)来检测RSK4基因启动子区甲基化状态,分析其与RSK4表达、BRAF V600E突变及临床病理特征的相关性。运用RT-qPCR、Western blot及BGS检测甲状腺癌细胞系TPC-1、BHT101及正常甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1中RSK4 mRNA、蛋白表达量及启动子区甲基化状态;运用去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza,10μM)处理以上3种细胞系后,RT-qPCR和Western blot检测RSK4表达量变化,CCK8实验检测5-Aza对TPC-1和BHT101细胞增殖能力的影响;在BHT101中敲降BRAF V600E后,RT-qPCR与BGS分别检测RSK4 mRNA水平和甲基化状态;。2.shRNA慢病毒干扰PTC细胞系(BCPAP)中RSK4,采用TMT相对定量蛋白质组学分析筛选出受RSK4调控的蛋白质。在敲降RSK4的BCPAP中,首先运用RT-qPCR和Western blot对筛选出的PODXL表达量进行验证,之后转染PODXL过表达质粒,Western blot检测外源性PODXL蛋白变化情况,最后在细胞中加入CHX抑制蛋白质合成,分别在0h,2h,4h,8h,16h,24h各时间点收取细胞蛋白,Western blot分析RSK4对PODXL蛋白降解的影响。RT-qPCR和Western blot检测PTC组织和癌旁组织中PODXL表达。过表达或敲降BCPAP中PODXL,Western blot分析其对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响。结果1.(1)PTC中RSK4 mRNA水平显著低于癌旁组织;MSP结果显示PTC中RSK4基因启动子甲基化阳性率高于癌旁组织,PTC组织中甲基化组RSK4 m RNA水平低于非甲基化组;BGS同样证明PTC中RSK4启动子甲基化率高于癌旁组织,PTC组织中RSK4甲基化率与mRNA水平呈负相关。(2)BRAF V600E突变PTC患者RSK4表达量显著低于无BRAF V600E突变患者,但不管是否具有BRAF V600E突变,PTC组织中RSK4水平均低于癌旁组织;BRAF V600E突变患者PTC组织RSK4甲基化阳性率高于癌旁组织,无BRAF V600E突变患者癌与癌旁甲基化阳性率无显著差异。(3)有淋巴结转移患者PTC组织RSK4甲基化率高于无淋巴结转移患者,肿瘤直径>1cm患者PTC组织RSK4甲基化率高于肿瘤直径≤1cm患者。(4)TPC-1、BHT101中RSK4 mRNA与蛋白表达量均低于Nthy-ori3-1,而RSK4启动子甲基化率明显高于Nthy-ori3-1;(5)去甲基化药物5?Aza处理细胞后,TPC-1、BHT101中RSK4 mRNA和蛋白表达量部分恢复,细胞增殖能力受到抑制。(6)敲降BHT101细胞中BRAF V600E引起RSK4 mRNA水平升高,启动子甲基化率降低。2.(1)TMT相对定量蛋白质组学结果显示,敲降BCPAP中RSK4后,51种蛋白质表达发生显著改变,其中PODXL为上调最明显的蛋白之一。(2)敲降RSK4后,BCPAP中内源性及外源性PODXL蛋白表达均明显升高,PODXL mRNA水平无明显变化。(3)PTC组织中PODXL蛋白水平的明显高于癌旁组织,PODXL mRNA水平在癌与癌旁组织中无显著差异。(4)敲降RSK4后PODXL蛋白质降解明显减慢。(5)敲降PODXL使细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平降低,过表达PODXL则使ERK磷酸化水平增加。结论1.PTC中RSK4表达降低的机制之一为启动子区CpG岛高甲基化,其表达及甲基化状态受BRAF V600E影响,RSK4甲基化状态与肿瘤增殖与淋巴结转移相关,其有可能成为PTC早期诊断及治疗的分子靶点。2.RSK4可以促进PODXL蛋白降解,其对PODXL的调控可能为转录后水平,PODXL可以增强MAPK通路活性,初步推测RSK4-PODXL通路的异常激活了MAPK通路。