论文部分内容阅读
黄芩为唇形科(Labiatae)植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根,是常用中药,性寒、味苦。具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。黄芩多见于阳光充足的向阳山坡、林缘、稀疏草丛中,耐热、耐寒、耐旱、忌积水,-35℃安全越冬,能耐35℃的高温。黄芩的主要有效成分黄芩苷(Baicalin),是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物,具有显著的生物活性。近年来,黄芩的药用量逐年上升,有限的野生资源遭到了掠夺性采挖,资源短缺使其价格居高不下。黄芩毛状根的培养将使黄芩苷生产实现工业化,有着重要的经济价值。本课题运用遗传转化和组织培养技术,采用共培养法,利用发根农杆菌(Agrobacterizum rhizogenes)1.2556中的Ri质粒侵染不同的黄芩外植体,诱导产生毛状根。并探讨了转化过程中外植体、预培养、侵染时间、乙酰丁香酮等因素对毛状根诱导率的影响。在单因素实验的基础上,利用Box-Benhnkcn设计和响应面分析法对培养时间、培养温度、摇床转速、接种量等影响培养条件的因素进行分析,建立黄芩毛状根的离体培养体系。对Ri质粒介导的黄芩毛状根中的黄芩苷应用大孔吸附树脂进行分离与纯化,纯化后的黄芩苷用高效液相色谱法进行检测。研究表明,通过共培养法实现了黄芩毛状根的遗传转化。毛状根密集簇生,无向地性,普遍水平生长,在无外源激素的MS培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。外植体黄芩茎段、根段等均能产生毛状根,但茎段诱导率最高,可达到47%。黄芩外植体预培养两天,侵染时间为10-15min,添加100μmol/L的乙酰丁香酮,共培养两天最佳。在MS培养基中加入400mg/L抗生素头孢曲松钠能较好地抑制发根农杆菌生长,提高黄芩外植体的诱导率。通过对毛状根鲜重量的比较,优化出毛状根的最优培养条件为:1/2MS培养基中,加入30g/L蔗糖,pH值6.0、培养时间25d、温度27.4℃、摇床转速123r/min、接种量0.5g,黑暗下培养,有利于毛状根生长及次级代谢产物黄芩苷的生物合成。通过大孔吸附树脂法对黄芩毛状根提取液进行分离与纯化,确定黄芩毛状根提取液中含有黄芩苷;运用HPLC对纯化后的黄芩苷检测表明,培养25天的黄芩毛状根中黄芩苷的含量可达5.37%。