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贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为淀粉液化芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌亲缘相近的新种,三者均是生产surfactin的主要菌种。surfactin是构成抗菌脂肽的核心成分,具有极强的生物表面活性,表现出优异的抗菌作用及良好的起泡性和乳化性能,在食品、医药、化妆品和养殖等领域中发挥着重要的作用。然而目前大多数芽孢杆菌的surfactin产率较低,其中的原因也尚不知晓,是制约surfactin大规模生产和商业化应用的主要原因。此外,目前微生物发酵生产surfactin的工艺中,常通过转速提升增加溶氧量以实现surfactin的过量积累。但是具有生物表面活性剂特性的surfactin在转速过高的环境中会形成过量泡沫而出现“跑液”现象,进而造成surfactin的大量损耗。所以溶氧环境是决定surfactin产量的关键因素。因此,本论文以高产surfactin的贝莱斯芽孢杆菌CMT-6为研究菌株,利用全基因组从头测序技术分析CMT-6的基因组信息,挖掘合成surfactin的关联基因,同时与另外三株产量较低的芽孢杆菌进行比较基因组学研究,揭示surfactin合成能力差异的原因,解析高产菌株的surfactin合成基因的特征,进一步利用转录组学技术研究不同溶氧条件下CMT-6的转录组信息,探明溶氧调控surfactin合成的关键基因和代谢通路,为天然高产菌株的高效筛选和工程菌株的构建,以及为低氧高产surfactin生产工艺的研发奠定理论基础和提供新的思路。主要研究内容与结果如下:1、对CMT-6进行全基因组从头测序,分析CMT-6基因组组分及功能,特异性筛查抗菌脂肽相关基因,并采用TOF-MS技术检测CMT-6发酵液中脂肽成分。结果表明,CMT-6基因组为3,928,489 bp,GC含量为46.55%。COG注释得到的基因主要涉及碳水化合物、氨基酸转运和代谢和次级代谢产物的生物合成、转运和分解代谢等。KEGG注释得到的基因主要参与碳水化合物代谢和信号传导路径中。注释到GO中的基因主要行使催化活性、代谢过程和细胞分化过程。以上这些基因能使菌体高效响应外界环境变化,为CMT-6的生长提供营养物质,编码合成更多的脂肽前体物质。CMT-6含有完整的surfactin合成酶基因,srfAA-AD;合成surfactin的相关基因比iturin和fengycin的多。CMT-6发酵产物含有的surfactin组分(m/z:994.6,1008.6,1009.6,1010.6,1022.6,1036.6)比iturin(m/z:1044.6,1058.6,1059.6)和fengycin(m/z:1434.6)的丰富。脂肽合成基因的数量与脂肽组分的丰富度呈正相关,是CMT-6过量积累surfactin的重要原因。2、选取不同种属的芽孢杆菌B.subtilis 168、B.amyloliquefaciens DSM7~T和B.velezensis FZB 42,与CMT-6的基因组进行比较分析,从基因组水平揭示不同种属芽孢杆菌产surfactin能力差异的来源。结果显示,CMT-6与FZB 42有非常保守的序列结构,亲缘关系最近,其次为DSM7~T,与168菌株的亲缘关系最远。不同菌株间的共线性关系与亲缘关系吻合,遗传背景会引起菌株合成surfactin能力的差异。CMT-6与FZB 42和DSM7~T均共有5个surfactin合成基因;与168菌株仅有3个共有基因,相似度较低。菌株间共有基因的数量及其相似度影响surfactin的合成。CMT-6与FZB42仅有合成酶基因srfAC发生非同义突变,与DSM7~T的合成酶基因srfAA、srfAB、srfAC及相关基因spoVT、codY存在非同义突变,与168菌株除上述基因的非同义突变外,其srfAA还检测到提前终止密码子。合成酶基因发生的非同义突变会改变对氨基酸的特异性选择,造成surfactin组分的差异。而合成酶中提前终止密码子的出现,会直接导致菌体丧失合成surfactin的能力。3、设置转速分别为50 rpm(低溶氧)、100 rpm(中溶氧)、200 rpm(高溶氧)的溶氧组,收集菌体提取RNA进行转录组测序分析,研究不同溶氧处理条件下的转录组表达差异,挖掘溶氧调控surfactin的合成的关键基因和通路。结果发现,转录组差异最大的是低溶氧组和中溶氧组,其差异基因功能主要富集到细菌型依赖鞭毛的运动和鞭毛基底两个GO Item中和metabolic pathways的代谢通路上。中溶氧和高溶氧组的差异基因富集到7个GO Item中(集中在氧化还原过程),KEGG富集到不同环境中微生物代谢、碳代谢和双组份系统三个通路上。从转录组表达情况分析发现高溶氧组中碳代谢、脂肪酸合成、双组份系统、蛋白释放等路径中基因的表达可以编码合成更多的surfactin前体物质,增强自身细胞对surfactin的耐受性,促进surfactin的外排,有利于surfactin产量的提高。surfactin合成酶基因srfAA、srfAC、srfAD与产量呈负相关,共同受sRNA rne5的调控;与产量呈正相关的基因有srfAB、spoVT、AbrB、comP和rapC。