论文部分内容阅读
背景:树突状细胞(dendritic cells,DCs)是机体内功能最强的专职抗原提呈细胞,在固有免疫和适应性免疫中扮演重要角色。DCs强大的免疫调节能力使其成为肿瘤免疫治疗中的热点,但在临床应用中并没有达到预期效果。DCs的成熟程度及分化方向,与免疫微环境中的炎性因子及刺激信号密切相关。肿瘤细胞可以通过分泌多种免疫抑制因子,特别是Th2类细胞因子IL-10、TGF-β等,抑制DCs的活性。肿瘤微环境下调了 DCs表面CD1 1c、主要组织相容性复合物MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86等的表达,使DCs分泌高水平的Th2类细胞因子,以抑制Th1和CTLs增殖,有利于Treg细胞分化,这也是造成肿瘤免疫逃逸的机制之一。β-葡聚糖是广泛存在于自然界中的大分子多糖,是一种重要的病原体相关模式分子,被DCs等免疫细胞表面的模式识别受体识别,增强免疫应答。全葡聚糖颗粒(whole glucanparticle,WGP)是一个大小与原酵母菌细胞基本相同的中空β-葡聚糖球体,为不溶性颗粒。我们前期研究表明,WGP可以诱导小鼠骨髓来源DCs和人单核细胞来源DCs的成熟,增强其抗肿瘤免疫功能。本研究在体外模拟肿瘤微环境,在诱导DCs分化过程中,加入IL-10、TGF-β共培养,诱导肿瘤驯化的免疫抑制性树突状细胞(tumor-educated dendritic cells,TEDCs),研究全葡聚糖颗粒对TEDCs免疫功能的影响。目的:体外模拟肿瘤微环境驯化的免疫抑制性树突状细胞(TEDCs),研究全葡聚糖颗粒(WGP)对其免疫功能的影响及信号通路。方法:采用Flt3L法诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞来源的DCs,同时加入IL-10、TGF-β共培养,诱导得到TEDCs,再加入WGP刺激2天。磁珠分选出OT-I和OT-Ⅱ小鼠淋巴结和脾脏中的CD8+T和CD4+T细胞,加入特异性抗原(OVA),再与TEDCs共培养。流式细胞术(FCM)检测细胞表面分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,CD8+T和CD4+T细胞的分化增殖情况。实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测 TEDCs 细胞因子 TNF-α IL-12p40、IL-10、IL-4、TGF-β1、iNOS、Arginase 和趋化因子受体 CCR1、CCR2、CCR7 等的 mRNA表达水平。ELISA法检测TEDCs培养上清中细胞因子TNF-α、IL-12p70、IL-4、和IL-23的分泌水平。TranswelITM检测TEDCs对CCL19和CCL21的趋化迁移反应,FCM检测从小鼠足垫迁移至引流淋巴结的TEDCs数量。在C57BL/6小鼠皮下注射鼠源肺癌细胞株LLC、TEDCs和WGP,测量肿瘤生长过程中的大小及重量,FCM检测体内实体瘤、脾脏和引流淋巴结中的CD11b+F4/80+巨噬细胞,CD11b+Gr-1+细胞和CD4+PD-1+T细胞比例。Western Blot法检测WGP对TEDCs胞内蛋白ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平的改变。TEDCs经ERK1/2、p38 MAPK特异性抑制剂U0126、SB203580分别预处理2 h,检测WGP对TEDCs细胞相关表面分子和细胞因子的影响。结果:WGP可以上调TEDCs表面分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,促进细胞因子TNF-α、IL-12p40和iNOS的表达和分泌,降低TGF-β1 和 Arginase mRNA 水平,诱导 CD4+IFNγ+T 和 CD8+IFNγ+ 细胞上调,有效抑制CD4+Foxp3+T细胞。WGP还可以增加TEDCs趋化因子受体CCR7的表达,提高其对CCL19和CCL21的趋化反应能力。WGP抑制小鼠体内实体瘤的生长,促进肿瘤和脾脏中的CD11b+F4/80+巨噬细胞增加,上调肿瘤中的CD1 1b+Gr-1+细胞,抑制淋巴结中CD4+PD-1+T细胞。WGP增强TEDCs的ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平,通过ERK1/2和p38 MAPK信号通路上调TEDCs细胞相关表面分子的表达和细胞因子的分泌。结论:WGP可以改善TEDCs的免疫状态,增强其体内外迁移能力,抑制小鼠体内实体瘤的生长,通过ERK1/2和p38MAPK信号通路上调TEDCs细胞相关表面分子的表达和细胞因子的分泌,调节其免疫抑制功能。